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置顶HPV基因与宫颈癌
HPV基因组人乳头瘤病毒基因组是一闭环双股dna,分子量5×106道尔顿。按功能可分为早期区(e区)、晚期区(l区)和非编码区(ncr)三个区域。e区分为e1~e7开放阅读框架,主要编码与病毒复制、转录、调控和细胞转化有关的蛋白。l区分l1和l2,分别编码主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白。ncr是e区与l区间-6.4~1.0bp的dna片段,可负责转录和复制的调控。通过对人乳头瘤病毒克隆基因的dna杂交试验及酶谱分析,以核苷酸同源性少于50%定为新型别,至今已鉴定出100多型人乳头瘤病毒。每一型别都与体内特定感染部位和病变有关。人乳头瘤病毒各型之间有共同抗原,即属特异性抗原,存在于l1蛋白,它与牛乳头病毒(bpv)有交叉反应。l2蛋白为型特异性抗原,各型间不发生交叉反应。人乳头瘤病毒在体外细胞培养尚未完成。它具有宿主和组织特异性,只能感染人的皮肤和粘膜,不能感染动物。人乳头瘤病毒感染后在细胞核内增殖,细胞核着色深,核周围有一不着色的空晕,此种病变细胞称为空泡细胞(koilocytotic cell)。宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,占女性生殖器官恶性肿瘤的半数以上,严重威胁着妇女的健康。全世界每年大约有4万人患病,中国新发病例约计13万,占目前已发现的所有女性肿瘤的6%,是仅次于乳腺癌而引起妇女癌症相关死亡的重要原因。宫颈癌的发病机理目前尚不清楚,但已有很多研究证明,99%的宫颈癌组织中可检出人乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)[1-2]。目前,已经明确HPV感染为宫颈癌前病变和浸润性宫颈癌发生的必要条件[3-4]。大量研究资料表明,HPV与宫颈癌及癌前病变密切相关,高危型HPV(HRHPV)感染与宫颈癌关系最为密切[5]。随着病变程度的加重,HPV的检出率也逐渐增高[6]。所以,许多专家提出将HPV的检测作为宫颈癌的一种筛查手段。目前,针对HPVDNA检测作为宫颈癌原始筛查方法以及与细胞学联合在筛查中的意义的研究报道较多[7-10]。本文将就HPV检测方法的相关内容进行小结,重点介绍目前应用最为广泛的PCR法和杂交捕获试验。由于HPV至今尚不能在体外培养,又无合适的实验动物,因而对其检测主要依赖于形态学方法和分子生物学技术。目前HPV检测方法主要有细胞学法,斑点印迹法,荧光原位杂交法,Southern杂交法,多聚合酶链反应(PCR)法和杂交捕获法等。细胞学法敏感度和特异度较低;斑点印迹法具有放射性。目前较为公认的敏感度和特异度高的方法是捕获二代法;其它敏感度较高的方法有原位杂交,PCR法。但PCR法特异度很低,假阳性率较高;而核酶印迹原位杂交法复杂,不宜大规模临床使用。1. 细胞形态学检测宫颈 HPV 阳性细胞的特征性改变是出现了特异性挖空细胞。初期在表层出现,当不典型增生达2/3以上时,挖空细胞减少,此时表现为低分化鳞癌的形态特点。感染 HPV16,18 的宫颈上皮阳性为中层挖空细胞核出现了密集浓染的蓝紫色颗粒产物,从慢性宫颈炎→CIN→CaCx,HPV 杂交信号渐强,由上皮表层到棘层,分布呈散在→簇状→弥漫状。2. 免疫组织化学法 用SP法染色测 HPV16,18早期蛋E6 单抗能有效证明感染组织中存在的E6 蛋白,阳性标志为核内出现棕黄色颗粒。研究表明抗HPV16E6 单抗可直接定位于宫颈癌组织,对宫颈癌有较好定向选择性,有可能作为人宫颈癌放射免疫显影诊断的载体。3. 基因扩增技术3.1 HPV DNA 的PCR扩增 评价HPV检测方法最关键的因素是检测灵敏度,以基因扩增为基础检测HPV DNA,是目前最灵敏的检测方法,可检测出低水平的病毒感染,并且能够比较准确地对HPV感染状态进行分类,因此成为实验室和流行病学研究的理想工具。但是,由于基因扩增过程中污染造成的假阳性及技术成本高,目前不宜作为临床实验室HPV感染的常规检测。3.2 荧光定量PCR (FQ-PCR) 技术 FQ-PCR是1995年由美国Perkin Flmer公司研制成功的一种新型核酸定量检测方法,该法将普通PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性有机结合,克服了传统PCR在许多方面的缺点和局限性。由于荧光探针的引入,而且被释放的荧光基团数目与PCR产物数量相同,使得该方法对DNA模板定量的准确性与特异性都有很大提高。常用的PCR扩增仪与传统PC R扩增仪相比,应用更广泛、定量测量、检测效率明显提高、扩增产物无需电泳分析、无管道内污染及结果重复性好等特点。由于HPV-16型特异引物可与HPV66型模板DNA发生错配,传统PCR法扩增时,常对两者的扩增产物不易区分而造成HPV 16假阳性结果,但应用FQ-PCR技术,HPV 66型DNA不能扩增,从而增强了HPV分型检测的特异性。此外,FQ-PCR技术检测HPV感染的敏感性较传统PCR法增高,当HPV16, 18, 31, 33, 35亚型含量平均为1拷贝基因组/300个细胞时,即可用此法检测到。