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高危险性浅表性膀胱移行细胞癌（T1G3）的预后与p53、p21/W...
前 言 膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率均占首位。膀胱癌主要来自尿路上皮，90%以上是移行细胞癌。临床上根据膀胱癌移行细胞癌的浸润深度将其分为Tis、Ta、T1-4期，根据癌细胞的分化程度又将其分为G1-3级，通过分期和分级来判断预后，决定治疗方案。 目前，对低分期、低分级的膀胱癌大多采取保留膀胱的治疗，而对高分期、高分级者则行膀胱全切术。侵犯粘膜下层的、高分级的、常有原位癌伴发的膀胱癌被称为高危险性浅表性膀胱癌，以T1G3膀胱癌为代表，约占全部浅表性膀胱癌的6%—23%。这类低分期高分级的膀胱癌，虽属于浅表性肿瘤，却具有低分化癌易复发、易进展的生物学特性。临床上对T1G3膀胱癌的治疗方法存在争议，其焦点在于是否保留膀胱。北京安贞医院泌尿外科林云华 对于T1G3膀胱癌，准确地判断预后非常困难。而准确判断预后却是合理选择治疗方案的关键。影响膀胱癌预后的因素有很多，临床和病理学指标主要包括：肿瘤浸润深度（分期）、分化程度（分级）、是否伴发原位癌、淋巴转移情况、肿瘤大小、是否带蒂肿瘤、单发或多发、复发次数等，其中最主要的是前三项。高危险性浅表性膀胱癌与一般浅表性膀胱癌相比具有更明显的异质性（Heterogeneity），即使病理分期、分级完全相同，预后仍然有很大差别。特别是T1G3膀胱癌，其进展率高达33%—55%，明显高于浅表性膀胱癌的平均进展率（10%—28%）。临床资料表明，同样行膀胱全切术，T1期膀胱癌患者的预后明显要好于T2或更高分期者。与进展为浸润性膀胱癌或有淋巴转移后再行膀胱全切术的T1G3膀胱癌患者相比，那些在初次确诊后即行根治性手术的患者可获得更高的五年生存率。但如果对所有T1G3膀胱癌患者都不加选择地行膀胱全切又显过分，将使相当一部分原本保留膀胱也不会进展的患者的生活质量降低。因此，临床上对这种特殊膀胱癌的处理十分棘手。 由于T1G3膀胱癌的这种异质性，病理分期、分级和临床资料均无法准确描述其生物学特性，包括预后情况。人们开始在原有基础之上进行更深入的研究，以寻求新的预后判断标准。有作者提出把现有的T1期肿瘤再进一步分为浅部的粘膜下层浸润(T1a)和深部的粘膜肌层浸润(T1b)，并发现这两类患者在TURBt术后的进展率有显著差别（分别为7%和53%）。有作者提出以是否发生血管浸润来判断T1期膀胱癌的预后，未发生血管浸润的患者的五年生存率（81%）要明显高于有血管浸润者（44%）。近年来随着细胞学及分子生物学的发展，人们逐步认识到基因在肿瘤发生发展中起着重要的作用。通过对肿瘤分子标记物的研究间接了解肿瘤相关基因的变化，将比仅仅用形态学研究提供更本质、更准确的预后信息。 与膀胱癌预后有关的分子标记物很多，归结起来大致包括：ABO血型抗原、肿瘤相关抗原、细胞增殖相关的抗原、癌基因、生长因子及其受体、细胞粘附分子、血管增生因子及其抑制物以及细胞周期调节蛋白等。p53、p21/WAF1及pRb是已被证实的三种肿瘤抑制物，它们在细胞周期调控的不同层次上互相协调而又相对独立地发挥着各自的作用，同时又通过其他途径抑制肿瘤发生发展。很多研究表明，p53、p21/WAF1及pRb与膀胱癌的进展有非常密切的关系。 经文献检索，到目前为止尚无有关肿瘤标记物单独与T1G3这一特殊类型膀胱癌预后相互关系的报导；同时国内关于T1G3膀胱癌的报导也较少。本实验以p53、p21/WAF1和pRb为对象，通过免疫组化的方法研究它们与T1G3膀胱癌进展之间的关系，试图为临床上早期判断T1G3膀胱癌预后、选择适宜的治疗方案提供可能的帮助。 实验材料与方法 一． 临床资料： 本实验选取1990年至1998年间在北京医科大学第一医院泌尿科手术治疗的47例患者作为研究对象，其中行TURBt术者35例，行膀胱部分切除术者4例，行膀胱全切术者8例。47例患者中有男性40例，女性7例，年龄在32至83岁之间，均有2年或2年以上的随访资料。这些病例的存档石蜡切片经过北京医科大学泌尿外科研究所病理室医师重新诊断，病理均为膀胱移行细胞癌G3pT1。 二．主要仪器设备： 1． Olympus光学显微镜； 2． Leica石蜡切片机； 3． 101A-1型干燥箱； 4． 恒温水浴箱； 5． 医用微波炉； 6． 抗原修复盒； 7． 常用玻璃容器：广口瓶、量筒、量杯、烧杯、染色缸等； 8． 其它：载玻片、盖玻片、天平、冰箱、定时钟、切片架、切片盒、湿盒、毛笔、托盘、加样器、加样器枪头、EP管、刷子等。 三． 主要试剂及配制方法： 1． 抗体（一抗）： ⑴．p53抗体：DO-1鼠抗人IgG2a单抗, Santa Cruz公司产品，购自北京中山生物技术有限公司。规格：0.1ml，使用时以抗体稀释液按1:50稀释。 ⑵．抗体稀释液：购自北京中山生物技术有限公司。规格：6ml。 ⑶．p21/WAF1抗体：4D10鼠抗人IgG2a单抗，Maxim公司产品，购自北京岳泰生物技术公司。规格：3ml，工作液。 ⑷．pRb抗体：1F8鼠抗人IgG1单抗，Maxim公司产品，购自北京岳泰生物技术公司。规格：3ml，工作液。 2． p53阳性对照片：人乳腺癌组织 p21/WAF1阳性对照片：人结肠癌组织 pRb阳性对照片：人未分化乳腺癌组织 以上阳性对照片均购自北京岳泰生物技术公司。 3． Poly-L-Lysine防脱片剂：购自北京中山生物技术有限公司。规格：5ml，使用时以蒸馏水按1:10稀释。 4． SP-9000通用型试剂盒：购自北京中山生物技术有限公司。 试剂盒内容：1.封闭用正常羊血清工作液。规格：6ml。 2.通用型生物素标记的羊抗兔和鼠IgG抗体（二抗）。规格：6ml。 3.辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液（三抗）。规格：6ml。 5． 浓缩型DAB试剂盒：购自北京中山生物技术有限公司。 试剂盒内容：1.浓缩缓冲液（205）。规格：3ml。 2. DAB溶液（205）。规格：3ml。 3.浓缩过氧化氢溶液（205）。规格：3ml。 使用时先加一滴缓冲液于1ml蒸馏水中，混匀，再加DAB及H2O2各一滴，混匀后使用，在半小时内用完。 6． PBS缓冲液：0.01M、PH7.4，配制方法如下： 磷酸氢二钠 28.9g 磷酸二氢钾 2g 氯化钠 80g 氯化钾 2g 加蒸馏水至10000ml溶解。 7． 酸甲醇过氧化氢溶液的配制： 甲醇 100ml 36.5%HCL 0.074ml 使用时于90ml酸甲醇溶液中加入30% H2O21.5ml。 8． 1%盐酸酒精溶液： 36.5%盐酸溶液1ml用70%酒精稀释至100ml。 9． 微波炉抗原修复工作液：0.01M枸橼酸盐缓冲液，PH6.0 A液：称取21.01g枸橼酸（C6H8O7·H2O）溶于1000ml蒸馏水中。 B液：称取29.41g枸橼酸钠（C6H5O7Na3·2H2O）溶于1000ml蒸馏水中。 工作液：取9毫升A液和41毫升B液加入450ml蒸馏水中。 10． Harris苏木精溶液： 10%苏木精酒精溶液 10ml 10%硫酸铝钾水溶液 200ml 先将硫酸铝钾水溶液加热溶解，然后将溶化的苏木素酒精溶液倒入，继续加热煮沸1分钟，停火后缓慢加氧化汞0.5g，再加热煮沸1分钟，速将三角烧瓶放入冷水中冷却，再加冰醋酸6~10ml，目的是使细胞核着色力加强。 11． 0.1%胰蛋白酶溶液：称取100mg胰蛋白酶溶于100ml 0.1%的氯化钙水溶液（PH7.8）中。 12． 其它试剂：蒸馏水、无水乙醇、二甲苯等。 四． 实验方法： ㈠．石蜡切片制备： 1．玻片处理： ⑴．将新购进的载玻片和盖玻片经过泡酸、漂洗、95%乙醇浸泡后，以干净绸布擦干； ⑵．将擦净的载玻片浸于稀释的防脱片剂中，5分钟后捞出，晾干备用。 2．将所选石蜡标本切片，厚度5μm，置于备好的载玻片上，在干燥箱中60°C过夜，冷却后置于4°C冰箱保存备用。 ㈡．免疫组织化学染色方法（SP法）： 1．切片脱蜡至水： ⑴．脱蜡：二甲苯浸泡2次，20分钟/次，待切片基本透明时取出； ⑵．过100%酒精I、II，各5分钟； ⑶．梯度酒精湿化：95%、80%酒精各1次，5分钟/次； ⑷．最后蒸馏水冲洗、浸泡5分钟。 2．将切片浸入酸甲醇过氧化氢溶液，室温30分钟； 3．PBS冲洗，5分钟53次； 4．抗原修复： ⑴．*将切片放入0.1%胰蛋白酶溶液中，37℃消化30分钟； ⑵．*PBS冲洗，5分钟53次； ⑶．将切片插入盛有配好的抗原修复液的修复盒中，放入微波炉，置于高温档3分钟加热至98°C ~100°C，保持10分钟； ⑷．将修复盒取出自然冷却至室温； ⑸．PBS冲洗，5分钟53次。 *p53免疫组化染色可省略第⑴、⑵步。 5． 正常羊血清封闭，室温下置于湿盒孵育30分钟； 6． 倾去血清，滴加一抗，放在湿盒中4°C过夜； 7． PBS冲洗，5分钟53次； 8． 滴加生物素标记的二抗，室温下置于湿盒孵育30分钟； 9． PBS冲洗，5分钟53次； 10． 滴加辣根酶标记的链霉卵白素，室温下置于湿盒孵育30分钟； 11． PBS冲洗，5分钟53次； 12． 滴加DAB显色剂，显微镜下观察； 13． 充分显色后，自来水终止显色； 14． 蒸馏水浸泡1分钟； 15． 苏木精复染60秒； 16． 自来水冲洗； 17． 1%盐酸酒精溶液分化10秒； 18． 自来水冲洗10分钟返蓝； 19． 晾干，光学树脂封片； 20． 4°C暗处保存。 ㈢．染色结果判定方法： 1． 染色质量控制：每次实验均以两张阳性对照切片（外购）作为质量控制片，一片加入一抗作为阳性对照，另一片加入0.01M PBS作为空白对照。只有在此两张切片染色效果满意时，才对同时染色的未知标本切片进行结果评估。具体情况见下表： 免疫组化结果的分析 编号 阳性对照 空白对照 标本 结果说明 1 - -/+ -/+ 实验步骤错误 2 + + + 抗体非特异着色 3 + - - 标本中不含有所需抗原 4 + - + 标本中含有所需抗原 2．染色结果判定：p53、p21/WAF1和pRb在免疫组化中阳性结果均表现为细胞核着深棕色。参考大多数文献的评判标准，将着色肿瘤细胞数<10%者视为阴性（-），着色肿瘤细胞数≥10%者视为阳性（+）。pRb结果的判定较为特殊：其阳性结果中若肿瘤细胞呈现深浅不一的着色，视为阳性（+）；若肿瘤细胞呈现均匀、一致的强着色，则视为强阳性（++），强阳性和阴性（-）一样都提示pRb的异常[121,122,128]。 五．统计分析方法： 在北京医科大学第一医院医学统计室协助下，应用SPSS统计学软件，分别采用单因素分析、Cox模型多因素分析和卡方检验的方法，当P<0.05时，具有统计学意义。 结 果 一．临床结果： 47例患者中，行保留膀胱手术者（TURBt或膀胱部分切除术）共39例，这些患者是本实验的主要研究对象。另外8例行膀胱全切术者不涉及复发和肿瘤浸润加深的问题，因而只在研究p53、p21/WAF1和pRb三者之间相关性时才计入。 经过2—10年的随访，39例患者中共有29例复发，总复发率为74.4%。其中有23例发生了进展，进展率为59%（略高于文献报导的33%—55%），发生于术后2—95个月不等，平均进展时间为31.2个月。进展者中肿瘤浸润程度加深、侵及周围组织或发生盆腔淋巴结转移的14例（35.9%），发生远处转移的9例（23.1%）。有2例患者于术后一年发生了输尿管移行细胞癌，1例于术后四年发生了肾盂多发乳头状移行细胞癌伴粘膜原位癌。单纯复发者共有6例，占全部患者的15.4%，均发生于术后两年内，复发次数1—7次不等。未复发且未进展者仅10例，占25.6%。 在行TURBt的35例患者中，有20例发生进展（57.1%）。行膀胱部分切除术的4例患者中，有3例进展（75%）。行膀胱全切术的8例患者中，有1例于术后2年发现了肺转移（进展）。 39例患者中，初发时有原位癌伴发的2例（另8例已行膀胱全切术，不在讨论范围内），术后全部进展（100%）；无原位癌伴发的37例患者有21例进展（56.8%）。术后未行膀胱灌注治疗的4例患者全部进展（100%）；而行膀胱灌注治疗的35例患者，共有19例发生进展（54.3%）。单发肿瘤共21例，有11例进展（52.4%）；多发肿瘤共18例，有12例进展（66.7%）。肿瘤的大小为0.5—4.0cm，其中≥2cm的肿瘤共25例，有13例进展（52%）；≥3cm的肿瘤共8例，有6例进展（75%）；4cm的肿瘤2例均进展（100%）。39例患者影象学均未见淋巴转移。 二．免疫组化染色结果： 本实验研究的肿瘤标记物中，p53阳性者共26例（阳性率66.7%），其中进展者22例（84.6%）；阴性者共13例（阴性率33.3%），进展者1例（7.7%）。p21/WAF1阳性者共17例（阳性率48.6%），其中进展者6例（35.3%）；阴性者共22例（阴性率51.4%），进展者17例（77.3%）。pRb正常者(+)共11例（正常率28.2%），其中进展者2例（18.1%）；异常者(-或++)共28例（异常率71.8%），进展者21例（75%）[注：pRb（-）者20例，有15例进展（75%）；pRb（++）者8例，有6例进展（75%）。据文献报导这两种表型均属异常表达[121,122,128]，其患者复发、进展率相似，与本实验结果相符，为统计和叙述方便，加以合并]。 本实验将p53、p21和pRb两两结合以及三者结合又产生了四个新的指标：p53p21、p53pRb、p21pRb以及p53p21pRb。p53p21正常者（即p53-且p21+）9例，其中有1例进展（11.1%）；异常者（即p53+且p21-）20例，有18例进展（90%）。p53pRb正常者（即p53-且pRb+）6例，均未进展；异常者（即p53+且pRb-或++）24例，其中22例进展（91.7%）。p21pRb正常者（即p21+且pRb+）6例，均未进展；异常者（即p21-且pRb-或++）22例，其中18例进展（81.2%）。p53p21pRb正常者（p53-且p21+且pRb+）6例，均未进展；异常者（p53+且p21-且pRb-或++）19例，其中18例进展（94.7%）。 三．统计结果： 在单因素分析中，与T1G3膀胱癌预后相关的指标包括：p53(p<0.01,p=0.0032)、p21（p<0.05）、pRb（p<0.05）、p53p21（p<0.01,p=0.0027）、p53pRb（p<0.01,p=0.0013）、p21pRb（p<0.01,p=0.0065）和p53p21pRb（p<0.01,p=0.0010）。这些指标的异常与T1G3膀胱癌的进展之间有显著相关性。 为去除各个因素之间的交叉影响，本实验运用Cox多元回归模型进行多因素分析，结果仅有p53pRb和p53p21pRb的异常表达与T1G3膀胱癌的进展呈现显著相关性（p值分别小于0.05和0.01）。 最后将p53与p21、p53与pRb、p21与pRb的表达情况分别用卡方检验进行了相关性分析，结果发现p53的异常表达与p21的异常表达有显著相关性（χ2=6.5, p<0.05），而p53或p21的异常表达与pRb的异常表达之间均无显著相关性（χ2分别等于3.26和1.34，p>0.05）。[注：在研究肿瘤标记物两两之间表达的相关性的时候，由于不涉及术式和随访，因而将8例膀胱全切的标本也包括在内，共47例。] 上述主要指标与T1G3膀胱癌进展的关系概括如下表： 术式 单发 多发 原位癌 TURBt 部分切除 膀胱全切 有 无 进展 20 3 1 11 12 2 21 未进展 15 1 7 10 6 0 16 淋巴转移 灌注治疗 p53 p21 pRb 有 无 有 无 + - + - + -/++ 进展 0 23 19 4 22 1 6 17 2 21 未进展 0 16 21 0 4 12 11 5 9 7 p53p21 p53pRb p21pRb p53p21pRb 正常 异常 正常 异常 正常 异常 正常 异常 进展 1 18 0 22 0 18 0 18 未进展 8 2 6 2 6 4 6 1 p21 pRb pRb + - + -/++ + -/++ p53 + 6 22 p53 + 4 24 p21 + 6 11 - 11 8 - 8 11 - 6 24 讨 论 膀胱移行细胞癌是泌尿系统中发病率和死亡率均占首位的恶性肿瘤，临床上通常采用TNM分期和G1-G3分级来判断其预后。对低分期分级的膀胱癌大多采取保留膀胱的治疗，而对高分期分级者则多行膀胱全切术。但还有一类介于二者之间的低分期高分级的肿瘤，它虽属于浅表性膀胱癌，却具有低分化肿瘤易复发进展的生物学特性，被称为高危险性浅表性膀胱癌，以T1G3膀胱癌为代表。 由于T1G3膀胱癌的异质性，仅依靠现有的病理分期分级并不能准确估计其预后，因而使治疗方案的选择十分棘手。行保留膀胱的手术（TURBt或膀胱部分切除术）后进展率可高达33%—55%[7—12]，本实验的结果为59%（其中远处转移者占23.1%），略高于文献报导。在本实验的随访资料中，未复发且未进展者仅占25.6%，有3例于术后发生了上尿路肿瘤（国外一20年随访资料报导T1G3膀胱癌未复发且未进展者仅占7%[6]，而另一则15年随访资料报导[13]21%的T1G3膀胱癌患者最终发生了上尿路肿瘤，这些资料从不同角度反映了T1G3膀胱癌的“高危险性”所在）。临床资料表明，同样行膀胱全切术，T1期膀胱癌患者的预后明显要好于T2或更高分期者。这部分患者假如在初发时即行膀胱全切术，生存率将大有提高[21]。但如果对所有患者都不加选择地行膀胱全切又显过分，将使相当一部分原本保留膀胱也不会进展的患者的生活质量降低。因此积极寻找现有病理分期分级以外的能够判断预后的辅助指标显然十分重要。一旦找到可靠的指标，我们在T1G3膀胱癌初发时就能判断其日后进展的可能性，从而尽早决定是否保留膀胱。 在影响膀胱癌预后的众多因素中， p53、p21/WAF1和pRb是作用机制较为清楚、实验方法较为成熟的肿瘤抑制物。很多研究结果表明，这三个因素的异常与膀胱癌的复发和进展有着十分密切的联系。 目前对p53、p21、Rb基因及其蛋白产物的研究手段主要有免疫组织化学、PCR-SSCP和序列分析等，其中以前者使用最广泛。免疫组化已经被证实是检测p53、p21和pRb异常表达的可靠手段[107,113,126,127]，因而本实验选取了与临床结合紧密、简便、经济的免疫组化作为实验方法。 p53基因发现于1979年[42]，是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因，在大多数的肿瘤（包括膀胱癌）中都可以检测到p53基因的突变或丢失[43]。野生型p53在细胞中只能维持很短的时间，通过免疫组化方法一般不能检测到（阴性）；突变后的p53可结合一种热休克蛋白导致半衰期延长，因而可由免疫组化检测出来（阳性）[124]。Sarkis等[100]对43例行TUR的T1膀胱癌患者进行了随访观察，发现肿瘤细胞核中p53的过度表达与肿瘤进展高度相关，提出p53在细胞核中的表达状况是一个重要的预后指标，对正确选择治疗手段可能有帮助。Esrig等[101]对243例膀胱癌患者的研究表明：肿瘤细胞核p53过度表达的患者与无过度表达的患者相比其复发、进展率显著升高，而存活率则显著下降，特别是对局限于膀胱的肿瘤（T1-T3a），p53异常表达是独立于肿瘤分级、分期和淋巴结转移等状况的指标。类似报导还很多[102-117]。在本实验中，p53阳性患者肿瘤进展的高达84.6%（22/26），而p53阴性者仅7.7%（1/13）发生进展，在单因素分析中，p53异常表达与T1G3膀胱癌进展有显著相关性(p=0.0032<0.01)。基础研究表明，p53基因位于人类染色体17p13.1，其编码的蛋白质是由393个氨基酸组成的分子量为53kD的核磷酸蛋白，即p53蛋白[45]。野生型p53蛋白的生物学功能主要是使细胞周期阻滞[48]和诱导细胞凋亡[49]。当细胞受到电离辐射、化学致突变原等的作用导致DNA损伤时，可诱导p53的转录、翻译，使细胞内p53的含量迅速上升[51，53]。p53与序列特异性的DNA结合，激活p21/WAF1（位于6p21.1）基因的转录，合成一种由164个氨基酸组成的、分子量21kD的蛋白，即p21/WAF1[48，54]。 p21/WAF1也具有肿瘤抑制功能，其功能状况主要取决于细胞中p21蛋白的表达水平。p21功能丧失后在免疫组化染色中表现为细胞核中无着色（阴性），而功能正常时则呈现阳性，可以通过免疫组化来检测[113]。Stein等对242例膀胱癌患者的术后随访发现p21/WAF1免疫组化核染色阳性的患者与阴性者相比具有较高的术后生存率以及较低的复发进展率，p21的染色状况可作为独立于肿瘤分期、分级和p53状况的预后指标[111]。Clasen等的研究结果表明，p21/WAF1在浅表的、高分化的膀胱癌中阳性率要高于浸润性癌，提示p21可能对肿瘤发展起抑制作用[112]。在本实验中p21阴性者有77.3%（17/22）发生进展，而阳性者进展率为35.3%（6/17），在单因素分析中，p21的异常表达与T1G3膀胱癌进展显著相关（p<0.05）。现已证实p21/WAF1是一种广泛的Cdk抑制物，可抑制包括CyclinA-, B-, D-, E-与Cdc2, Cdk2, Cdk4, Cdk5所组成的几乎所有的Cyclin-Cdk复合物的活性[55,56]，从而使细胞周期停滞于G1期，不进入S期合成DNA。而后，这些细胞或者修复DNA[57]，或者被诱导凋亡[58]。这样，只有基因组完整而稳定的细胞才能继续合成DNA，完成分裂。倘若在一些情况下（例如基因突变、病毒蛋白或癌蛋白结合p53等），野生型p53的功能受到抑制，将导致其不能激活p21/WAF1的转录和合成，不能抑制Cyclin-Cdk复合物，从而失去对细胞周期的阻滞功能，DNA受损的细胞从G1期进入S期。这些基因组不稳定的细胞易发生突变及染色体重组，导致其克隆不断膨胀，同时因失去程序化死亡（凋亡）的调控而永生化，这与肿瘤的发生发展有密切关系[52,63]。 由上述机制中可以看出，p21功能主要是受调控其基因转录的物质（如p53）的影响。当p53功能异常时，激活p21基因转录的能力下降，可导致p21蛋白的表达水平下降[54]。与Stein等的结论相似[119]，在本实验最后相关性分析中，p53表达的正常与否和p21表达的正常与否存在着显著的相关性（p<0.05）。这正好印证了以上的机制。 Rb（视网膜母细胞瘤）基因位于人类染色体的13q14，其编码的核磷酸蛋白为pRb，分子量约105kD。最初是在遗传性视网膜母细胞瘤患者的肿瘤中发现了Rb基因的缺失[82,83]，此后，在很多人类肿瘤中都发现有Rb基因的突变及pRb的异常表达[84—87]，目前已经证实了pRb是一种肿瘤抑制物。pRb功能的丧失在免疫组化染色中表现为细胞核中无着色（阴性）。Cordon-Cardo和Logothetis等的研究结果不谋而合[117,118]：他们发现浸润性膀胱癌的癌细胞核中pRb的阴性表达提示肿瘤预后不良，并认为这是一项重要的独立预后指标。近年来的文献报导细胞核中pRb过度表达与阴性表达一样也提示其功能的异常[121,122,128]，但机制尚未完全阐明，可能与pRb的过度磷酸化有关。在本实验中， pRb（-）者20例，有15例进展（75%）；pRb（++）者8例，有6例进展（75%）。二者进展率恰相等，与文献报导相似，为统计和叙述方便，加以合并。合并后pRb异常者（-或++）有75%（21/28）发生进展，而pRb正常者（+）仅18.1%（2/11）进展，在单因素分析中，pRb的异常表达与T1G3膀胱癌的进展显著相关（p<0.05）。pRb分子中有一个功能性的蛋白结合位点称为“口袋”区（“pocket”domain）[88]，“口袋”区能够与一系列细胞蛋白结合，其中包括E2F家族[89] （E2F家族是一类转录因子，能够激活一些促使DNA复制和细胞周期前进所需的基因的转录，帮助细胞由G1期进入S期[84]）。pRb的分子结构有两种功能状态[41,52]：当pRb处于去磷酸化状态时，可以结合E2F，抑制其转录因子功能，从而阻止细胞的DNA复制及合成，使细胞周期停滞于G1期以修复受损的DNA；当pRb处于磷酸化状态时则与E2F分离，失去对细胞周期的阻滞功能，E2F促使DNA受损的细胞从G1期进入S期，细胞周期继续前进[52]。因此，pRb功能的异常与肿瘤的发生发展密切相关。而使pRb磷酸化失去结合E2F能力的正是受p21/WAF1抑制的Cyclin-Cdk复合物，这样便形成了一条p53-p21-pRb的联系通路（如下图）。然而这并非一条唯一通路：作为pRb的上游基因，p53和p21虽然能够通过一系列的中间环节影响pRb的功能，但是其他因素（如P15、P16、P27 、Rb基因本身突变或缺失等）也都能够影响pRb，使之在细胞核中出现异常表达，并且这种影响是不能忽略的。在本实验相关性分析中， p53或p21的异常表达与pRb的异常表达之间均没有显著相关性（p>0.05），也恰好说明了这一点。 p53-p21-pRb通路示意图 M G2 S G1 DNA复制 细胞周期前进 P E2F _ _ + + p53 p21/WAF1 EGF,FGF等 Cyclin-Cdk复合物 P15,P16,P27等 细胞周期 pRb pRb—P E2F + + 在本实验中，我们将p53与p21两种因素结合起来分析（简称p53p21），结果发现p53p21表达异常（p53+且p21-）者进展率高达90%（18/20），p53p21表达正常（p53-且p21+）者进展率11.1%（1/9）。在单因素分析中，p53p21的异常表达与T1G3膀胱癌进展之间有显著相关性（p=0.0027<0.01），并且相关性高于单用其中一个指标分析者。国外研究也曾显示：在p53阳性表达的膀胱癌患者中，p21阴性者预后明显不良，并且这是独立于分期、分级的淋巴结转移情况的指标[111,113]。其可能的机制如下：除了p53依赖性的p21激活通路外，还存在着p53非依赖性的p21激活通路，例如[77]EGF、FGF等也能激活p21的转录。这样当p53功能丧失时，其他因子仍可以激活转录p21/WAF1，维持一定的细胞周期调控功能。另外，Waga等的研究发现p21/WAF1还能直接抑制PCNA（增殖细胞核抗原）依赖性的DNA复制[78]。因此，若DNA在S期之前受损，p21可通过抑制Cyclin-Cdk复合物而阻止细胞进入S期；若DNA在S期受损，p21可通过抑制PCNA而中止DNA的复制。除了细胞周期抑制以外，p21/WAF1也具有诱导凋亡的作用，但其机制尚未完全阐明[79,80]。反过来，p53除了能使细胞周期阻滞以外，还能通过它所调控的基因间接参与细胞周期、细胞增殖、血管生成、DNA修复、细胞分化、生长因子信号传导和凋亡等基本生命过程的调节[50,51]。这样，当p21功能丧失而p53功能存在时，p53尚可通过细胞周期以外的途径起到一定的肿瘤抑制作用。但是如果两者功能都丧失（这时会出现p53p21的异常表达），那么肿瘤进展的可能性就会高于仅有一个因素异常者。 将p53与pRb结合起来分析（简称p53pRb），结果发现p53pRb表达异常（p53+且pRb-/++）者肿瘤进展率为91.7%（22/24），p53pRb表达正常（p53-且pRb+）者肿瘤进展率为0（0/6）。在单因素分析中，p53pRb的异常表达与T1G3膀胱癌进展之间有显著相关性（p=0.0013<0.01），并且相关性高于单用其中一个指标分析者。国外一些文献也曾把p53与pRb结合起来研究，结果发现p53阳性而pRb阴性者其肿瘤复发率、进展率和死亡率均明显高于p53阴性而pRb阳性者，仅p53阳性或仅pRb阴性者预后状况居中[120—122]。因为pRb虽然是p53的下游基因，但它的功能并不完全受p53控制，其他因素如P15、P16、P27甚至EGF、FGF等也能够通过Cyclin-Cdk复合物间接影响pRb的磷酸化，而且Rb基因本身突变或缺失、病毒蛋白结合“口袋”区等都能够影响pRb功能而使pRb表达异常。因此，如果p53或pRb其中之一功能异常，另一个还能够起到一定的保护作用；若二者均异常（此时p53pRb表达异常），那么肿瘤复发、进展的机率都将增加。 再将p21与pRb结合起来分析（简称p21pRb），结果p21pRb表达异常（p21-且pRb-/++）者肿瘤进展率为81.2%（18/22），p21pRb表达正常（p21+且pRb+）者肿瘤进展率为0（0/6）。同样，在单因素分析中p21pRb的异常表达与T1G3膀胱癌进展之间有显著相关性（p=0.0065<0.01），并且相关性高于单用其中一个指标分析者。目前国内外文献尚未有将这两种因素结合分析者，其可能的机制和p53p21、p53pRb者相似。 按照排列组合的思路，再把三个指标结合起来（简称p53p21pRb）联系预后。结果发现p53p21pRb表达异常（p53+、p21-且pRb-/++）者肿瘤进展率为94.7%（18/19）；p53p21pRb表达正常（p53-、p21+且pRb+）者进展率为0（0/6）。在单因素分析中，p53p21pRb的异常表达与T1G3膀胱癌进展之间具有显著的相关性（p=0.0010<0.01），并且是所有单因素分析中最具统计学意义的指标。 然而，要讨论T1G3膀胱癌预后，仅仅作单因素分析显然是片面的，因为肿瘤的发生、发展是多种因素共同作用的结果。我们又选择了临床上常用的一些对判断预后有参考意义的指标（包括术式、是否伴发原位癌、淋巴转移情况、肿瘤大小、单发或多发、是否进行膀胱灌注治疗等），将它们同本实验的研究对象合并在一起进行多因素分析（Cox多元回归模型），以便去除这些因素之间的交叉影响。最后只筛选出两个与T1G3膀胱癌的进展有显著相关性的指标：p53pRb和p53p21pRb（p值分别小于0.05和0.01）。即在本实验中，p53、pRb同时表达异常，或者p53、p21、pRb三者同时表达异常的T1G3膀胱癌患者其进展率显著高于其他患者，三个指标同时异常对判断预后的意义更大。 p53、p21和pRb在正常状态下都具有肿瘤抑制功能，由p53-p21-pRb通路的机制我们可以看出，它们在不同的层次上相对独立而又互相联系地发挥着各自的作用。p53能够诱导p21/WAF1的转录合成，p21/WAF1抑制了Cyclin-Cdk复合物的活性，使之减少对pRb的磷酸化作用，这样pRb就可以与E2F牢固结合，从而阻止了E2F的细胞周期促进作用，细胞停滞于G1期。就这样，p53通过这一系列环节最终实现了对DNA受损细胞的周期阻滞作用，使之有时间修复DNA或进一步被诱导凋亡。但由于这条通路上还存在着非p53依赖性的“支线”，以及存在着除细胞周期阻滞以外其他抑制肿瘤的机制，因而当p53、p21/WAF1、pRb其中某一因素功能异常时，其他因素还可以维持一定的肿瘤抑制功能。但是如果三者都丧失了功能，那么肿瘤进展的机会肯定将大大增加。正因为如此，p53p21pRb的异常表达对预测T1G3膀胱癌的进展最具参考价值。 在本实验中p53、p21/WAF1和pRb的异常表达率（分别为66.7%、51.4%和71.8%）略高于文献报导的数字（分别为39%—58%[100—103,120,126]、36%—45%[113,115]和37%—55%[117,118,121,122]），可能的原因如下：（1）三种标记物在低分化的G3膀胱癌中的异常表达率要高于浅表性膀胱癌或膀胱癌的平均水平；（2）所用抗体及实验步骤不完全相同以及实验误差所致；（3）本实验样本例数相对较小，几例的差别就会对百分数造成较大影响。 在比较术式对预后的影响时我们发现，TURBt术后有57.1%（20/35）进展，膀胱部分切除术后有75%进展（3/4），二者的差别无显著性。据文献报导，膀胱部分切除术后肿瘤的复发率略低于TURBt术[35]，但只用于不易电切的部位或憩室内癌。8例膀胱全切的患者术后仅1例发生远处转移，显然膀胱全切是效果最好的术式，只是生活质量低于保留膀胱者。 本实验的39例T1G3膀胱癌患者中，初发时有原位癌伴发的2例（另8例已行膀胱全切术，不在讨论范围内），术后全部进展；术后未行膀胱灌注治疗的4例患者全部进展。虽然在多因素分析中，有原位癌伴发和膀胱灌注治疗并不是有统计学意义的指标（很可能是由于例数太少），但也提示我们有原位癌伴发和术后不作膀胱灌注治疗的膀胱癌预后较差。这一点与临床实际经验相符。 在本实验中有淋巴转移者均已行膀胱全切术，不在39例主要研究对象之内，故未能观察其对复发和进展的影响。但临床上普遍认为有淋巴转移者肿瘤预后较差。 多发肿瘤的进展率为66.7%，略高于单发肿瘤的进展率（52.4%），在统计学分析中这个差别没有显著意义，我们只能说多发肿瘤的预后可能偏差些。 在临床上，膀胱癌体积大小被认为是影响预后的重要因素，但目前没有一个统一的大小分界。有文献报导说大于5cm的膀胱癌预后明显较差[16]。在本实验中，≥2cm的肿瘤进展率为52%（13/25），≥3cm的肿瘤进展率为75%（6/8），4cm的肿瘤均发生进展（2/2），没有5cm以上的肿瘤，提示肿瘤越大其预后也越差。但是要找出能影响预后的有统计学意义的大小分界标准需要很大的样本例数，这是本实验未能达到的。 肿瘤的发生发展是一个极其复杂的过程，没有哪一个因素能够单独决定肿瘤的生物学行为，而是多种因素在同时起着作用，相互之间存在交叉影响。正因为如此，原本用单因素分析法有意义的一些指标在多因素分析时失去了统计学意义。我们虽然主要从细胞周期阻滞的角度来讨论肿瘤的发生发展，但作为肿瘤抑制物，p53、p21和pRb的功能还不止这些；除了我们研究的对象以外，还有很多其他因素也影响着肿瘤的进展，与膀胱癌关系比较密切的肿瘤标记物也还有很多，例如细胞增殖抗原Ki-67、表皮生长因子受体EGF-R、细胞粘附分子E-Cadherin、血管内皮生长因子VEGF、血管生长抑制因子Thrombospondin-1以及细胞周期调节蛋白P16、P27等等，这些还有待于我们今后的继续研究。 本实验仅以临床上治疗争议较大的T1G3膀胱癌这一特例作为研究对象，但是如果能够在更大的样本、更长的随访期以及前瞻性研究中得到相同的结果，那么这个结论不仅将为选择T1G3膀胱癌的治疗方案提供重要的参考，而且将会加深人们对于膀胱癌的认识。 小 结 本实验对1990—1998年手术治疗的47例T1G3膀胱移行细胞癌患者（其中39例保留膀胱，8例膀胱全切）进行了随访，对其石蜡包埋的病理切片进行了针对p53、p21/WAF1和pRb的免疫组化染色，将染色结果同临床资料结合分析。 结果：39例保留膀胱的T1G3膀胱癌患者的总进展率为59%。8例行膀胱全切术的患者有1例于术后2年发生肺转移。肿瘤细胞核p53、p21/WAF1和pRb的异常表达率分别为66.7%、51.4%和71.8%。p53和pRb二者同时，或者p53、p21/WAF1和pRb三者同时异常表达的T1G3膀胱癌预后明显较差，其中三者同时异常对判断进展更有意义。 结论：T1G3膀胱移行细胞癌是一种潜在恶性程度较高的浅表性膀胱肿瘤。p53、p21/WAF1、pRb蛋白的表达情况可以在临床综合判断的基础上为T1G3膀胱癌的预后判断提供更进一步的生物学依据。 附 图 参 考 文 献 Landis SH, Murray T, Bolden S, et al: Cancer statistics, 1999. 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