Detection of TE-1 and SKOV3 Cancer Cells after Transfecting Antisense VEGF by Laser Scanning Confocal Microscopy∥FENG Wei, ZHENG Xiao, WANG Yue-zhen, et al. 封 巍，郑 晓，王跃珍，王 准 （浙江省肿瘤医院，浙江 杭州 310022）

摘 要： ［目的］ 应用激光共聚焦显微镜检测转染至食管癌TE-1 细胞及卵巢癌 SKOV3 细胞内 反义 VEGF 寡核苷酸上荧光物质含量及转染对细胞凋亡的影响。 ［方法］ 传代培养食管癌TE-1 细胞及卵巢癌 SKOV3 细胞，取 VEGF 反义寡核苷酸，按 0.1μmol/L 组、0.3μmol/L 组及 0.5μmol/L 组转染两种细胞， 正义寡核苷酸 0.3μmol/L 同时转染作为对照。 激光共聚焦显微镜观察VEGF 寡核苷酸转染荧光图像，比较反义 VEGF 寡核苷酸的不同浓度在两种细胞摄入情况。 流式细胞 术检测不同浓度转染两组细胞的凋亡差异。 ［结果］ 食管癌 TE-1 细胞及卵巢癌 SKOV3 细胞不 同浓度寡核苷酸转染24h 荧光强度分别为32.69±2.94、51.48±5.76、56.62±1.2 和 72.56±2.01、 96.42±3.21、98.54±2.07， 两组荧光强度与对照组相比均有显著性差异 （ P <0.01），TE-1 细胞及 SKOV3 细胞 0.3μmol/L 组及 0.5μmol/L 组之间荧光强度无显著性差异。 TE-1 细胞各浓度组凋亡 指数较对照组有显著差异，而 SKOV3 细胞中凋亡指数较对照组无显著性差异。 ［结论］ 激光共 聚焦显微成像技术能进行活细胞水平转染效率的定量检测，对选择合适转染浓度有帮助，提示 不同癌细胞使用相同浓度抗血管生成药物可能效果有差异。 主题词：食管肿瘤；卵巢肿瘤；激光共聚焦显微镜荧光强度；凋亡指数 中图分类号：R730.23 文献标识码：A 文章编号：1671-170X（2011）02-0111-04

新生血管是绝大多数实体瘤复发和转移的重要 机制之一。血管内皮生长因子（VEGF）通过与受体结 合，刺激内皮细胞的增殖、移行，增加血管的通透性， 促进血管的生成。 阻断血管生成已经成为治疗肿瘤 的一个新途径[1]。 近年来，人们采用反义技术封闭癌 基因的表达来治疗肿瘤并应用于临床， 但治疗效果 差异较大， 我们使用反义 VEGF 寡核苷酸转染 VEGF 高表达的食管癌与卵巢癌细胞， 使用激光共 聚焦显微镜实时观察反义寡核苷酸的分布， 为临床 治疗提供有意义的参考。

1 材料与方法

1.1 材 料 LipofectamineTM2000（Gibco 公司）；流式细胞仪；激 光共聚焦显微镜 TCS-SPα（德国 Leica 公司），RPMI1640 培养基与 0.25%胰酶（Sigma 公司），胎牛血清

购自 Gibco 公司， 其它试剂均为进口或国产分析纯 级。 食管癌细胞株 TE-1 与卵巢癌 SKOV3 细胞由河 北医科大学第四医院科研中心馈赠。 VEGF 反义脱 氧寡核苷酸（寡核苷酸）采用中国科学院上海生化所 金由辛教授设计的寡核苷酸序列。反义寡核苷酸：5′ -GCAGTAGCTGCGCTGATAGTGC-3′，对照正义寡核 苷酸：5′G-CACTATCAGCGCAGCTACTGC-3′由上海 生工公司合成，均经硫代磷酸修饰，5′端多肽荧光修 饰，冷冻干燥后用 RPMI-1640 培养液稀释成所需浓 度备用。 1.2 转 染 食管癌 TE-1 细胞与卵巢癌 SKOV3 细胞在 37℃、5%CO2 的条件下， 用含 10%已灭活胎牛血清 和双抗的 RPMI-1640 培养基培养，3d 传代， 胰酶消 化离心，沉淀中加入 1ml 完全培养基制成细胞悬液， 计数，取适量细胞悬液稀释后铺入培养皿中接种（约 2×105/ml），70%融合。 按照脂质体说明书中的步骤， 取 2.0 OD 的 VEGF 寡核苷酸， 按 0.1μmol/L 组、 0.3μmol/L 组及 0.5μmol/L 组各溶于不含抗生素及 新生牛血清的 RPMI-1640 培养液中，各组终体积均 为 250μl， 此为 A 液； 取 30μl 脂质体（Lipofec

基金项目：浙江省医药卫生优秀青年科技人才专项基金（2008QN005）； 卫生部科学研究基金—浙江省医药卫生重大科技计划项目 （WKJ2007-2-004）；河北科学技术研究与发展计划项目 （08276101D-46）；浙江省中药管理局项目（2008CA036） 收稿日期：2010-06-23；修回日期：2010-11-16

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肿瘤学杂志 2011 年第 17 卷第 2 期

Journal of Chinese Oncology,2011,Vol.17,No.2

B：0.1μmol/L C：0.3μmol/L D：0.5μ A mol/L ：对照组 图 2 激光共聚焦显微镜下 VEGF 反义寡核苷酸转染后卵巢癌 SKOV3 细胞中的荧光表达

B：0.1μmol/L C：0.3μmol/L D：0.5μ A mol/L ：对照组

图 1 激光共聚焦显微镜下 VEGF 反义寡核苷酸转染后 TE-1 细胞中的荧光表达

tamineTM2000）溶于不含抗生素及新生牛血清的 RPMI1640 培养液 750μl 中，此为 B 液；放置 10min 充分 溶解后，A 液 3 组各 250μl，加入 B 液各 250μl 新鲜 配制后放置 30min，轻柔地把两者混匀（简称 C 液）， 室温下放置 30min，使其充分反应。 用不含抗生素及 新生牛血清冲洗 3 遍培养好 TE-1 细胞的 25cm2 培 养瓶， 各加入 1.5ml 不含抗生素及新生牛血清的 RPMI-1640 培养液，加入 C 液。 37℃、5%CO2 孵育 6h 后，换 2ml 含 10%胎牛血清的培养基继续培养。 1.3 激光共聚焦显微镜观察 各组 VEGF 寡核苷酸转染的细胞， 细胞爬片置 载玻片， 分别于 24h 终止孵育， 将培养皿固定于 LSCM 载物台上，激光共聚焦显微镜观察，在荧光显 微镜下初调焦平面， 观察细胞状态及负载情况。 用 20×物镜观察区域及层面， 选择 488nm 氩离子激光 预扫描，采集荧光图像。 设置扫描条件：①激发光波 长 488nm，发射光波长 543nm。 ②扫描方式：时间序 列扫描。 ③扫描密度：1 024×1 024；参数确定后，开 始扫描，采集细胞图像，并存入计算机硬盘。 ④图像 分析与数据处理： 用激光扫描共聚焦显微镜自带图 像分析系统进行图像分析与数据处理， 测出细胞内 平均荧光强度。

1.4 流式细胞技术检测细胞凋亡 ⑴弃对数生长期的单层培养细胞中的培养液， 加入 1~2ml 0.25%胰酶消化细胞，见细胞变圆，终止 消化反应。 加入 3~4ml 无 Ca2+、Mg2+的 PBS 液，用吸 管反复吹打，使成为单细胞悬液，离心去上清。 ⑵用 细滴管将细胞迅速注入 4℃、70%冷乙醇中，4℃冰箱 中固定 24h。 ⑶调整细胞浓度为 1×106 细胞/ml，取 1ml 细胞悬液，加入 0.5%胃蛋白酶 2ml，37℃水浴中 孵育 30min，同时振荡悬浮 2 次，再用 PBS 液 10ml 终止消化；1 000r/min 离心 2min，弃上清液。 ⑷加入 1ml EB 染液（50μg/ml）一步插入法进行 DNA 染色， 0～4℃保存 30min，用 500 目铜网过滤后上机测定。 1.5 统计学处理 采用 SPSS11.0 统计软件，多组数值间比较采用 方差分析。 P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 荧光共聚焦显微镜观察结果 反义 VEGF 寡核苷酸的不同浓度在细胞摄入情 况见图 1、2。 随 VEGF 寡核苷酸浓度升高，细胞摄入 VEGF 寡核苷酸逐渐增多。 食管癌 TE-1 细胞及卵巢细胞则首先从细胞浆开始出现荧光， 高浓度的情况 下细胞核内也含有荧光。 本研究利用脂质体 LipofectamineTM2000 作为基因转移系统[5]，其带有多个正电 荷， 能与细胞表面的负电荷相互结合， 带负电荷的 DNA 结合到带正电荷的脂质体形成脂质体-DNA 复 合物后，容易被细胞捕获进入细胞内。我们设想可以 通过激光共聚焦显微镜测定细胞内荧光物质的含量 反映癌细胞捕获反义 VEGF 寡核苷酸的数量。 细胞增殖及凋亡调控异常是肿瘤细胞与正常细 胞的特征性区别，VEGF 与细胞凋亡之间存在着密 切关系, 癌细胞捕获反义 VEGF 寡核苷酸的数量增 多， 会对癌细胞凋亡有一定影响。 本文结果显示， 0.5μmol/L 组反义 VEGF 寡核苷酸转染 SKOV3 细胞 并未如同相同浓度的反义 VEGF 寡核苷酸转染 TE1 细胞引起凋亡指数显著性增加， 两者荧光强度几 乎相差一倍， 是由于细胞内 VEGF 基因受抑制还是 由于寡核苷酸的毒性或脂质体的毒性作用引起还需 进一步研究，也可能与肿瘤细胞类型相关。目前研究 已注意到肿瘤细胞 VEGF 旁分泌与自分泌的区别： 旁分泌为分泌产生的 VEGF 可作用于相邻基质血管 内皮细胞 VEGF 受体， 促进血管内皮细胞分裂、增 殖，诱导肿瘤血管新生，增加血管通透性，促进肿瘤 生长转移； 自分泌为作用于肿瘤细胞自身功能性的 血管内皮细胞生长因子受体， 使自身相关蛋白发生 磷酸化，形成所谓的肿瘤细胞 VECF 自分泌环。 Bai 等[6]使用 RNA 干扰技术沉默 VEGF 基因的表达，可 以使卵巢癌细胞在裸鼠中的生长几乎停滞， 凋亡增 加，但其在体外实验中并未观察到凋亡增加。此结果 可能与 VEGF 的分泌方式相关。在体内，抗凋亡相关 蛋白 survivin 有促进肿瘤血管生成的功能，Tu 等[7]采 用腺病毒介导的 survivin Cys84Ala 突变体转染结肠 癌细胞，survivin 表达降低后在体内即可观察到肿 瘤组织的血管生成显著性减少。该突变体作用于胃 癌细胞株， 种植到裸鼠后， 观察到同样的效应[8]。 Coma 等[9]采用 siRNAs 和反义寡核苷酸抑制 survivin 表达， 使肿瘤内毛细血管形成显著减少。 反之， VEGF可以加强抗凋亡蛋白 livin 的表达出现抗凋亡 作用[10]。 目前为了检测抗 VEGF 的贝伐单抗的毒性， 将其注入兔眼玻璃体中，5mg 剂量已可以观察到正 常细胞的凋亡[11]。 相同浓度的反义 VEGF 寡核苷酸 对不同肿瘤细胞的凋亡指数影响不同， 应该是多种 因素作用的结果。