超声引导下甲状腺细针穿刺活检分子生物学诊断进展

 1、背景介绍：

甲状腺结节是临床上最常见的甲状腺病变。超声在甲状腺结节评估中具有很高的敏感性及特异性，然其仅能对甲状腺结节的实现初步评估，无法给予明确的定性诊断。细针穿刺活检开始于上世纪80年代，目前超声引导下细针穿刺活检已成为甲状腺结节评估的金标准：一方面超声可疑提供甲状腺结节的重要信息如回声情况、边界、形状，有无钙化、血流情况等。另外超声赋予细针穿刺活检精确定位的优势，极大降低了假阴性穿刺及取样的不满意情况。US-FNAB应用于临床以来，由于其对可疑甲状腺结节特异筛选及对穿刺靶向定位作用，对绝大多数结节均能实现术前评估，从而减少良性结节患者的不必要手术并能检出恶性结节患者，使其得以及时治疗。

2、适应症：

US-FNAB适应症以美国甲状腺协会提出的适应症应用最为广泛：

1）：结节直径大于5mm且伴有甲状腺癌高风险病史（甲状腺癌家族史，头颈部放射史，甲状腺癌手术切除史，多发性内分泌肿瘤，降钙素大于100pg/ml）。

2）结节任意大小伴有颈部淋巴结转移征象（淋巴结肿大，正常形态消失，皮髓质分界不清，内部伴有微小钙化或液化）。

3）直径大于1cm的实性结节。

4）结节直径大于5mm，但本身具有恶性超声征象。

近年来微小甲状腺恶性肿瘤的发生率已经上升，目前尚无循证的指南指导如何处理超声下直径小于5mm的结节。有学者认为≤5mm结节，由于超声检查的假阳性率和穿刺标本的不满意率较高，即使具有恶性超声特征，不建议行US-FNAB。Moon等通过对3117个≤5mm结节的连续超声检测及临床病理结果比较，发现恶性结节占47.4%，其中仅有5.8%的恶性结节及6.8 %良性结节在术前12月超声随访中直径增加2-3mm。而其他研究发现微小甲状腺癌在5年随访6.4-7%的结节发生增长，因此其建议≤5mm的结节需行超声随访，如果发现结节增大至少50%，且待其直径大于5mm时考虑行FNAB。另若≤5mm的甲状腺结节存在超声可疑恶性征象且患者意愿强烈，可由丰富经验的医师尝试US-FNAB。

另外对于直径大于4cm结节，由于结节的不均质性，施行FNAB亦需慎重，McCoy等研究发现大于4cm结节行FNAB良性的结节其恶性风险高达13%。Pinchot等研究中FNAB良性结果的恶性风险为8%，其中取材不满意结节的恶性风险为27.3%。因此，对于直径≥4cm的甲状腺结节可绕开FNAB直接行手术治疗。

3、细胞病理学诊断：

细针穿刺病理结果在不同文献中具有很大统计差异性，这削弱了对FNAB在甲状腺中的临床实用性准确认识，目前Bethesda报告系统是甲状腺FNAB的细胞病理报告的金标准已达成共识。Bethesda报告系统具有标准化，可再现性，其能最终提高甲状腺FNAB临床重要性、有用性及预测价值 。可以准确反应FNAB在甲状腺良恶性结节评价中的临床应用价值。Bethesda报告系统对甲状腺FNAB病理结果分类如下。参见表1.

表1 甲状腺细胞病理学诊断分类、隐含的恶性风险及临床处理

3.1、穿刺取材不足或者不满意：

US-FNAB中标本取材不满意率约为2%-20%，是US-FNAB临床应用的主要局限性之一。影响US-FNAB取材满意率的因素主要包括结节本身特点（大小、囊性变、钙化、高血供等）、穿刺医师的操作经验、涂片技术及细胞病理学医师的经验等。Korean指南指出每个操作医师需熟练掌握操作细节、穿刺标本细胞学准备及建立自己标准化的US-FNAB操作流程是保证标本取材的高满意率的关键。研究表明取材不满意的结节恶性风险高达2-14%，因此，取材不满意的结节不能当做良性结节处理，ATA指南中建议非诊断性结果需重复行US-FNAB，Choi等研究发现二次US-FNAB仍取材不足的情况仍高达20.5%，其主要影响因素在于结节本身性质如结节囊性大于50%、直径≤5mm，低回声等，且二次US-FNAB对结节恶性风险的评估为0.6%-3.2%，Chung等研究发现首次FNAB取材不满意，采用超声随访对结节良恶性判断的敏感性90%，特异性为65%，阳性预测值为29.5%，阴性预测值为97.6%，故超声在初次FNA为非诊断性结节的恶性评估是可行、有效的。特别是对于那些结节囊性大于50%、直径≤5mm及低回声的结节更推荐超声随访而非US-FNAB.

3.2、穿刺结果良性

ATA指南中指出细胞学为良性的结节恶性风险为0-3%，而Kihara等[17]通过对1877例病例比较其细胞病理与术后病理回顾研究性发现， FNAB良性的结节恶性风险为6%。Wang 等报道FNAB良性的结节恶性风险高达11%。这可能与治疗选择性偏倚有关，即在无其他临床危险因子情况下，多数FNAB良性的病人没有行手术治疗。许多研究表明FNAB良性的结节的超声恶性征象与病理诊断为恶性直接相关。因此，对FNAB良性的结节的处理需结合其临床背景仔细权衡，行超声的连续随访：对有体积增大超过50%或者超声恶性征象的FNAB良性的结节需高度重视，可行重复性US-FNAB。其中对于无恶性征象的结节行射频消融亦是一种较为安全有效的治疗方式。

3.3、穿刺结果不确定意义

ATA指南中FNAB不确定意义的结节恶性风险为5-15%，而Wang等通过对多中心甲状腺结节的细胞病理及组织病理学对比研究发现：FNAB为不能明确意义的不典型增生或滤泡性病变结节中术后组织病理为恶性的比率为34%。与其meta分析结果（34%）相一致。而Çuhaci等等研究发现不确定意义的结节恶性风险为 22.8 %。Lewis等发现不确定意义的结节恶性风险为 24%，均高于ATA指南中的比率，其原因可能是由于研究对象仅纳入行手术治疗的FNAB不能明确意义的患者，存在纳入偏倚所致。由于FNAB不能明确意义的结节的恶性风险性较高，多数患者被建议行诊断性手术治疗，然术后病理证实超过2/3的结节为良性病变，一方面手术治疗有2-10%可能会给患者留下严重的手术并发症，另一方面多数患者需要服用优甲乐替代治疗，严重影响了患者的生活治疗。因此对于这些患者甲状腺切除是不必要的。ATA指南指出US-FNAB不能明确意义的结节的处理可通过重复性FNAB进行评估 ，而有研究表明二次FNAB评估结节的恶性风险比率仅为19%。因此对于FNAB不能明确意义的结节术前评估仍是FNAB的一项重要挑战，而分子基因检测技术研究将有助于重新矫正FNAB不能明确意义的诊断，避免过度的手术治疗。

3.4 、US-FNAB其他结果

US-FNAB结果为可疑恶性、恶性均需行手术治疗，而滤泡性及嗜酸性粒细胞肿瘤的诊断主要看相关的组织学证据，如有无包膜、血管侵犯及其他浸润转移等，FNAB的细胞病理学无法获得结节的组织学特点，只能对此类病变进行初步筛查。Crippa等认为不能明确意义的不典型增生或滤泡性病变、滤泡性肿瘤或嗜酸粒细胞肿瘤，并无明确的分类界限，亦无法为临床医师提供足够的信息以决定患有甲状腺结节患者的治疗方案，因此可将两者合并为滤泡性增生至滤泡性肿瘤。通过联合术前超声及分子基因检测技术等评估结节性质，从而为患者确定最佳的治疗方案。

4、分子诊断学研究：

FNAB为良性或者无明确意义的结节，其假阴性结果仍是临床应用的一项重要挑战。目前通过细针穿刺标本对甲状腺病变常见突变基因如BRAF、K/R/H-RAS、RET/PTC, PAX8/PPAR等的分子检测已成为一项有效的辅助诊断工具，这能够帮助临床医生进行评估、制定最佳治疗方案，避免过度手术并指导手术术式选择。

4.1、FNAB联合甲状腺相关癌基因检测

甲状腺癌的基因组学研究为甲状腺癌的诊断、治疗与预后提供了重要的依据。目前较为明确的是RET/RAS/BRAF/MAPK信号通路上的突变基因如BRAF, RAS, RET/PTC, PAX8/PPAR等以及肿瘤抑制基因如TP53、PTEN等。最为常见的BRAF突变和甲状腺癌浸润转移密切相关， FNAB联合BRAF V600E基因检测技术上可行，性价比较高。US-FNAB联合BRAFV600E 突变对可疑结节进行随访，能够将 US-FNAB敏感性从83.3%提高到91.7%。2015ATA指南已将BRAF基因突变列为甲状腺癌复发风险中危组的分层因子。Nikiforov等研究发现BRAF, RET/PTC, PAX8/PPAR突变与癌症相关性接近100%。与Moses等研究结果相一致。RAS突变与癌症的恶性风险稍低约85%，余 RAS突变见于滤泡性腺瘤中。因甲状腺中各个突变BRAF, RAS, RET/PTC, PAX8/PPAR具有相互排它性，故单个基因的检测敏感性较低，Giordano等报道各基因的比率：BRAF(61%)、RET/PTC (2.4%)、RAS(12.5%)、PAX8/PPAR(0.8%)。因此多基因的联合筛检是提高敏感性的保证，以上任何突变的存在均预示着高恶性风险，一旦检测出任一基因均需诊断性手术治疗。

4.2、FNAB联合Tg洗脱液检测

FNAB洗脱液的Tg检测（FNAB-Tg）主要用于甲状腺癌患者伴有超声下颈部可疑转移淋巴结的鉴别。Kim等研究发现FNAB-Tg在术前诊断淋巴结转移的敏感性和特异性分别为95%、90.9%，在术后则分别为80%和100%。不受甲状腺腺体存在与否的影响，具有较高的诊断正确率(88.9% vs 93.2%)。FNA洗脱液Tg水平受多种因素影响比如：血清Tg-Ab水平、现存甲状腺的多少、洗脱液中Tg-Ab水平，TSH抑制治疗，是否行碘131治疗等，另外洗脱液中Tg诊断的参考水平目前尚无统一意见，Torres等[36]通过回顾分析发现文献报道的FNAB-Tg诊断切值点在0.9-39 ng/ml之间，其主要参考以下方式确定：①、患者血清Tg水平 ②、反应FNAB-Tg最佳敏感性和特异性分析的ROC曲线面积，③、FNAB-LN-C阴性的平均值±2 SD ④淋巴结病理为良性的最高FNAB-Tg值等，目前对FNAB-Tg结果的处理如下：①FNAB-Tg>100ng/ml，FNAB-Tg>10ng/ml且FNAB-Tg>sTg或者Tg> FNAB-LN-C阴性病人的平均值±2 SD，建议行颈淋巴结清扫，②FNAB-Tg<1ng/ml,FNAB-LN-C阴性建议随访，③Tg处于1-10 ng/ml需要根据临床及超声的证据决定是否行淋巴结清扫。FNAB-Tg是一种简单可靠技术，然适宜病人的选择标准，影响因素，分析方法及Tg的诊断参考水平等尚需进一步研究。

4.3、FNAB联合降钙素洗脱液检测

目前FNAB应用于诊断甲状腺髓样癌（MTC）的报道较少且正确率很低(63%) ，de Crea 等[39]报道以FNAB联合降钙素洗脱液检测(FNAB-Ct)> 10.4 pg/ml 且FNAB-CT/ sCT > 1.39作为诊断切点值， FNAB-C联合 FNAB-Ct 诊断的准确率为 98%，阳性预测值为 100%，阴性预测值为98%。 Trimboli等[37]以39.6 pg/ml 为诊断切点值，其中MTC中位FNAB-Ct 值为2000 pg/ml (58-10000 pg/ml)，而对照组为 2.7 pg/ml (<2-13 pg/ml) (P < 0.001)，诊断敏感性及特异性均为100%[37]。Diazzi等[38]研究发现MTC的FNAB-Ct值多大于1000 pg/ml，FNAB-Ct值在36- 1000 pg/ml时需注意与C细胞增生鉴别。FNAB-Ct联合FNAB细胞学检测对于术前可疑MTC的患者是目前最可靠及准确方法，两者能够相互补充修正，极大提高诊断正确率从而为MTC患者的手术决策提供可靠的依据。

4.4、FNAB联合甲状旁腺素洗脱液检测

甲状旁腺病变在超声下往往与甲状腺病变难以区别，需与血清钙、血甲状旁腺素(PTH)及99mTcMIBI扫描检测进行定性及定位诊断。Triggiani等[40] 通过对55例可疑甲状旁腺病变行FNAB PTH检测，PTH在6.7-16640 pg/ml之间，其中23个病变行手术治疗，11例为甲状腺腺瘤，5例甲状腺增生，7例甲状腺病变。作者分析认为当FNAB-PTH>245 pg/ml时判定区分甲状旁腺与甲状腺病变的准确率较高。FNAB联合甲状旁腺素洗脱液检测目前研究报道很少，尚需更多的研究界定FNAB PTH的诊断切点值，并评估局部器官如喉返神经、血管损伤等并发症的风险。其在区分甲状旁腺及甲状腺病变方面具有重要的价值，有望作为术前甲状旁腺病变诊断的重要补充。

4.5、FNAB联合其他分子检测技术应用

下一代测序技术(next-generation sequencin，NGS)能够同时测序几千到百万短核酸序列，相比传统测序技术其可以在同时测序不同复杂程度的基因组区域，如：全基因组测序、全外显子测序、全转录子测序、多个基因阵列的靶向测序，高敏感性的检测出多种遗传突变。在甲状腺疾病中，这项技术可以实现目前已知的所有甲状腺癌相关基因的检测，评估甲状腺结节的恶性风险。Le Mercier等[42]通过对不确定性的FNAB行 NGS检测，甲状腺癌相关基因突变阳性的FNAB中71%术后病理为恶性， NGS能够明显提高FNAB的敏感性。Nikiforov 等[41]利用NGS检测FNAB为滤泡性肿瘤中甲状腺癌相关的13个基因突变及42个融合基因，通过对比术后病理发现其对恶性肿瘤诊断的敏感性为90%，特异性93%，阳性预测值83%，阴性预测值96%，准确性为92%。NGS可以实现对所有甲状腺癌相关基因的筛检，应用于FNAB的关键在于甲状腺癌相关基因组合的筛选，这是其高敏感性和特异性的保证，方能真正实现甲状腺结节的个体化的恶性风险评估、治疗方式选择、复发风险及预后评价，然而其技术要求高、费用昂贵推广难度大是其不足之处。

分子检测技术和FNAB的联合应用，为术前评估决策方面带来巨大的优势，极大提高了术前诊断的敏感性和特异性，有助于明确诊断，判断甲状腺癌病理类型和预后，指导选择合适的手术方式。

【结语】

FNAB已广泛应用于临床上甲状腺结节的良恶性评估并直接为临床诊疗提供最重要决策参考，而作为一项检测技术，其具有本身的局限性，特别是对于取材不满意、良性而超声可疑及诊断不明确的结节，仍是临床工作的一项重要挑战，此时细胞病理学诊断无法提供足够强的决策依据，分子检测技术作为FNAB的重要补充，能极大提高FNAB的敏感性及特异性，随着甲状腺癌遗传学机制的研究深入及新技术如NGS应用于FNAB，必将迎来甲状腺疾病精准医疗的新时代，为患者提供真正个体化的医疗服务。然而目前分子检测尚无法给FNAB提供确诊性诊断，仍需更多多中心前瞻性临床随机对照试验研究为甲状腺癌的诊治提供更多的循证医学证据。