胡宇慧  韩连书  叶军  邱文娟  张雅芬 杨艳玲  刘丽  麻宏伟  高晓岚  顾学范

 [摘要]  目的  研究丙酸血症患儿丙酰辅酶A羧化酶PCCA和PCCB基因突变情况。方法  应用PCR扩增和直接测序对11例丙酸血症患儿PCCA和PCCB基因的各个外显子及其两侧侧翼序列进行突变检测，并对部分患儿父母进行相应突变基因检测。结果  6例患儿为PCCA突变，5例为PCCB突变。共发现13种突变，其中10种突变未见文献报道，突变类型包括错义突变、缺失突变、剪切位点突变和复杂型插入缺失突变，错义突变为最常见类型。167-179del13ins1复杂型插入缺失突变在2例患儿中为纯合突变。结论  在11例丙酸血症患儿中检测到13种突变，其中10种为新突变类型，为今后有关丙酸血症的发病机制研究提供理论依据。上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书

[关键词] 丙酸血症；基因突变；外显子；

Gene mutation analysis in patients with Propionic acidemia

HU Yu-hui, HAN Lian-shu, YE Jun, QIU Wen-juan, ZHANG Ya-fen, YANG Yan-ling, LIU Li, MA Hong-wei, GAO Xiao-lan, GU Xue-fan. Shanghai Institute of Pediatics, Xinhua Hospital, Medical college of Shanghai Jiaotong University, Shanghai, 200092, China.

Corresponding author: HAN Lian-shu（ Email: xhhanlianshu@Yahoo.com.cn）

[Abstract] Objective  Propionic acidemia is a common organic acidemia, caused by deficiency of propionyl-CoA carboxylase (PCC), which catalyze the carboxylation of propionyl-CoA to D-methylmalonyl-CoA.PCC is a dodecameric enzyme of α-PCC and β-PCC subunits, nuclearly encoded by genes PCCA and PCCB, respectively. Mutation in either gene cause Propionic acidemia, the PCCA gene is located on chromosome 13q32 with 24 exons and the PCCB gene is located on chromosome 3q13.2-q22 with 15 exons. In this study, we analyzed gene mutations of 11 PCCA and PCCB deficient patients from China and to explore the possible mutation spectrum of Chinese patients. Methods  All 39 exons of PCCA and PCCB genes in 11 unrelated Chinese PA patients were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) and direct sequencing. Genomic DNA was extracted using Phenol-Chloroform method from the peripheral blood leukocytes of each patient. PCR amplification products were checked by 1.8% agarose gel electrophoresis and were subsequently sequenced with ABI 3700 Automated DNA Sequencer. Results  We identified 12 PA mutations, 7 affecting the PCCA gene, 5 affecting the PCCB gene, including 9 novel mutations and 3 previously reported mutations. Three missense mutations (1079T>G, 1102G>C and 1850T>C) and one short deletion (1863delA) were found in α-PCC subunit while three missense mutations (484G>A, 601G>A and 1253C>T) and two short insertion-deletions (167-179del13ins1, 560-561delCCinsT) were found in β-PCC subunit. The 167-179del13ins1 change was identified in two homozygous PA patients, with allelic frequency of 40% in β-PCC subunit deficiencies. Conclusion  Twelve mutations were found in 11 Chinese PA patients including nine novel mutations. No mutation is predominant in Chinese PCCA and PCCB deficient patients.

[Key words] Propionic acidemia；Exon；Mutation

丙酸血症（propionic acidemia, PA）是一种较常见的有机酸血症，系丙酰辅酶A（CoA）羧化酶活性缺乏，导致体内丙酸及其代谢产物前体异常蓄积，进而出现一系列生化异常与神经系统损害症状，属于常染色体隐性遗传病。由于酶缺陷程度不同，临床表现个体差异较大。典型临床症状表现为喂养困难、反复呕吐、酸中毒、惊厥和嗜睡等。丙酰CoA羧化酶为α，β两个亚单位组成的α6β6多聚体，α和β亚单位的编码基因分别为PCCA（MIM 232000）和PCCB（MIM 232050），两个基因的突变均会导致丙酸血症。PCCA基因定位于染色体13q32，含24个外显子，至今已发现54种基因突变；PCCB基因定位于3q13.3-q22，含15个外显子，共有56种突变报道[1]。为了解我国PA患儿丙酰CoA羧化酶PCCA基因和PCCB基因突变类型，本研究自2006年9月至2007年9月对11例中国PA患儿进行了基因突变分析。

对象和方法

一、对象

PA患儿11例：分别来自本院、北京大学第一医院儿科、广州市儿童医院和中国医科大学第二临床学院，其中5例收集了患儿父母的DNA。11例患儿均经串联质谱测定血中丙酰肉碱和甘氨酸，经气相色谱-质谱测定尿3-羟基丙酸和甲基枸橼酸确诊，诊断依据为丙酸血症的异常代谢产物，并参考既往文献[2,3]。同时通过血、尿常规、血气分析、血氨、血糖、血乳酸、肝肾功能和心肌酶谱测定等辅助检查了解病情程度。11例患儿相互间无血缘关系，父母系非近亲婚配。所有检查均获得患儿家长或监护人的知情同意。对照组为50例无血缘关系的健康成年人。

二、          方法

1. DNA提取：抽取患儿及部分患儿父母外周静脉血各4 ml，经抗凝后分离白细胞，使用苯酚-氯仿法提取DNA，－20°C保存。

2. 基因突变检测：利用PCR扩增DNA、直接测序检测基因突变：（1）引物设计与合成：22对PCCA引物应用引物设计软件Primer premier 5.0和Oligo 6.0自行设计，引物覆盖PCCA基因23对外显子及其两侧的侧翼序列（表1），另一对PCCA引物依据已发表文献合成[4]；15对PCCB引物皆依据Rodríguez-Pombo等[5]于1998年发表的文献设计。引物由上海赛百盛和上海生工公司合成。（2）PCR扩增：PCR反应体系为10×buffer 5 ml，12.5 mmol/L dNTPs 8 ml，引物各12.5 pmol/L 2ml，50 ng DNA 2 ml,去离子水补足50 ml。在PCR仪上首次变性温度为94°C、5 min，然后按变性温度94°C、1 min，退火温度51～63°C、45 s~1 min，延伸温度72°C、1 min，循环32～34圈，最后72°C延伸10 min。取4ml PCR产物，用1.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定目的条带。（3）PCR产物测序分析，使用博大泰克DNA片段快速胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化，纯化产物在ABI 3700测序仪上测序（上海基康公司）。突变或多态性位点通过比较GenBank 中PCCA DNA 序列(NC_000013.9；GI:4557818)和PCCB DNA序列（NC_000003.10；GI:89161205）确定。突变的命名参照http://www.hgvs. org/mutnomen 提供的命名法。突变阳性结果均经反向和重复测序证实。新突变通过查阅PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.giv/PubMed) 已报道的突变和PA数据库(http://www.uchsc.edu/cbs/pcc/pccmain.htm) 来确定，并在对照组中检测，排除多态性。

结  果

一、PA患儿的临床资料和实验室特点

PA患儿发病年龄为3天~8个月，临床表现主要为呕吐、嗜睡、惊厥、喂养困难和运动落后。实验室检查示酸中毒（血pH值6.9~7.3）、尿酮体（+）~（+++）、血乳酸增高（2.3~6.2 mmol/L，参考值< 2.0 mmol/L）和高血氨（94~300 mmol/L，参考值< 80 mmol/L）常见。串联质谱检测患儿干血滤纸片中丙酰肉碱水平（19.1±13.5，参考值< 5.0 mmol/L）、丙酰肉碱与游离肉碱比值(0.9±0.5，参考值<0.2)< font="">、丙酰肉碱与乙酰肉碱比值(1.8±0.7，参考值<0.3)< font="">和甘氨酸（702.9±198.4，参考值< 400 mmol/L）显著增高。气相色谱-质谱检测患儿尿液中3-羟基丙酸和甲基枸橼酸显著增高。

二、PA患儿突变检测结果

在11例PA患儿中发现13种基因突变类型（表2），包含9种错义突变、1种剪切位点突变和3种插入缺失突变（图1~图13）。其中1079T>G（图2）、1102G>C（图3）、1850T>C（图5）、1863delA（图6）、716-2A>G （图8）167-179del13ins1（图9）、560delCCinsA（图10）、484G>A（图11）、601G>A（图12）、c.1253C>T（图13）为新发现突变，正常对照组中未发现这10种突变。在6例患儿中检测到PCCA基因突变共8种，其中2例仅找到1个突变。对3例患儿父母的DNA进行了检测，病例5为716-2A>G （来自父亲）和2002G>A（来自母亲）杂合突变。病例2和病例6仅找到1个突变，分别为 1079T>G（来自母亲）和 2002G>A（来自父亲）。在5例患儿中检测到PCCB突变5种，3例为纯合突变，1例为杂合突变，1例仅找到1个突变。病例8为167-179del13ins1插入缺失纯合突变，在cDNA166和180位之间缺失碱基ACGCGCAGCACAA插入碱基C，其父母分别携带167-179del13ins1突变；病例9为484G>A（G162R）纯合突变，父母及姐姐为该突变的携带者；病例11仅检测到一个突变1253C>T（来自母亲）。

讨  论

丙酸血症是一种常见的有机酸血症，近几年我国在对PA的诊断和治疗方面已取得较大进步[6-8]，但尚未进行PA分子生物学相关研究。丙酸血症的临床确诊依赖于特殊的生化诊断，包括串联质谱检测患儿干血滤纸片中丙酰肉碱水平、丙酰肉碱与游离肉碱比值、丙酰肉碱与乙酰肉碱比值和甘氨酸显著增高；气相色谱-质谱检测患儿尿液中3-羟基丙酸和甲基枸橼酸显著增高。基因分析可以了解该病的分子生物学特征。

本研究在11例PA患儿中检测到13种突变，其中PCCA基因突变8种，PCCB基因突变5种。PCCA基因上突变集中于外显子21、13和22，PCCB基因上突变集中于外显子1、5和6。国外文献报道PCCA基因突变和PCCB基因突变分别于外显子13、12、19和18及外显子12、15、11和6常见，且不同国家不同民族间PA突变谱存在较大差异。在日本患者的PCCA基因中，922-923insT、1644-6C>G和R399Q突变占56%[9]。有关PCCB基因突变研究显示，日本患者中T428I、R410W和A153P突变分别占30％、26.7％和13.3%[9]，在高加索人患者中1218del14ins12（ins/del）突变最常见[10]，在西班牙和拉丁美洲患者中1172-1173insT和E168K突变较常见[11]，韩国患者中T428I最常见（56.3%）[12]，格陵兰因纽特人患者中1540insCCC突变最常见[13]。本研究未检测到上述热点突变，可能与种族不同有关。

PCCA包含两个功能单位，N-端的生物素羧化酶位点和C-端的生物素结合位点，本研究中检测到的8种PCCA突变（除716-2A>G外）所致的氨基酸改变均位于PCCA基因编码蛋白的两个功能区。PCCB基因中167-179del13ins1插入缺失突变在例7和例8患儿中为纯合突变，有可能为中国人群PCCB基因的常见突变。另外，在11例患儿中1850T>C 、2002G>A和484G>A突变类型均为2个等位基因突变，但因本研究中例数较少，尚不能确定是否为中国人群热点突变。例2、例6和例11仅发现1个等位基因突变，本研究未进行非翻译区、翻译调控区和基因启动子区突变检测，因此不排除在这些区域中存在突变。

在本研究检测到的13种突变中3种为已报道突变，其中PCCA基因229 C>T突变在高加索人群、日本人群和西班牙人群中均有报道[11,14,15]，可能为较广泛的突变；PCCA基因2002G>A突变在美国人群曾有报道[16]；1118T>A在西班牙人群中发现1例[15]。在10种新突变中PCCA基因有5种（716-2A>G 、1079T>G、1102G>C、1850T>C和1863delA）、PCCB有5种（167-179del13ins1、484G>A、560delCCinsA、601G>A和1253C>T），这些突变可能导致转录过程中外显子的跳跃、翻译中mRNA终止密码提前出现和翻译后产物的降解加速，翻译过程中抑制了α-β和/或β-β亚单位之间的相互作用，影响亚单位之间的装配而不能形成功能性丙酰CoA羧化酶低聚物[17]。716-2A>G突变位于ag-gt剪切位点上，可能导致转录过程中外显子10无法剪切，引起外显子10的跳跃；缺失突变1863delA导致cDNA 1873-1875位出现UGA终止密码，翻译后蛋白截短104个氨基酸。插入缺失突变中167-179del13ins1致使终产物减少4个氨基酸（谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸）；560delCCinsA在原位出现UAG终止密码，蛋白质截短353个氨基酸。错义突变中1102G>C导致氨基酸发生酸碱性改变，由酸性天冬氨酸变为碱性组氨酸；484G>A导致氨基酸极性改变，由非极性疏水性甘氨酸变为极性碱性精氨酸；1079T>G、1850T>C、601G>A和1253C>T未导致氨基酸极性和酸碱性改变。突变对酶蛋白的功能影响具有多样性，这6种错义突变对酶蛋白功能的影响需要进一步研究。对6例PA患儿父母进行突变基因检测，证实患儿突变基因均来自父母遗传，非新生突变。

本研究对PA患儿基因突变进行了初步分析，由于例数偏少，尚不能进行基因突变类型与临床表型相关分析，今后随着病例的增多，将可明确基因突变类型和临床表型间的关系，有助于PA发病机制研究，指导临床治疗和预后，并可对有需要的患儿家庭提供产前基因诊断。

参考文献

[1]  Desviat LR, Clavero S, Perez-Cerdá C, et al. New splicing mutations in propionic acidemia. J Hum Genet, 2006, 51:992-997.

[2] Chace DH, Kalas TA. A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing. Clinical Biochemistry, 2005, 38: 296– 309.

[3] Kuhara T. Diagnosis and monitoring of inborn errors of metabolism using urease-pretreatment of urine, isotope dilution, and gas chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography B, 2002, 781:497-517.

[4]  Campeau E, Desviat LR., Leclerc D, et al. Structure of the PCCA gene and distribution of mutations causing propionic acidemia. Mol Genet Metab, 2001, 74:238-247.

[5]  Rodríguez-Pombo P, Hoenicka J, Muro S, et al. Human propionyl-CoA carboxylase beta subunit gene: exon-intron definition and mutation spectrum in Spanish and Latin American propionic acidemia patients. Am J Hum Genet, 1998, 63:360-369.

[6]  杨艳玲，张月华，山口清次，等. 六例丙酸血症的诊断和治疗分析. 中华儿科杂志，2001，39:170-171.

[7]  顾学范，韩连书，高晓岚，等. 串联质谱技术在遗传性代谢病高危儿童筛查中的初步应用. 中华儿科杂志，2004，42:401-405.

[8]  韩连书，高晓岚，叶军，等. 串联质谱技术在有机酸血症筛查中的应用研究. 中华儿科杂志，2005,43:325-330.

[9]  Yang X, Sakamoto O, Matsubara Y, et al. Mutation spectrum of the PCCA and PCCB genes in Japanese patients with propionic acidemia. Mol Genet Metab, 2004, 81:335-342.

[10]  Campeau E, Dupuis L, Leclerc D, et al. Detection of a normally rare transcript in propionic acidemia patients with mRNA destabilizing mutations in the PCCA gene. Hum Mol Genet, 1999, 8:107-113.

[11] Pérez B, Desviat LR, Rodríguez-Pombo P, et al. Propionic acidemia: identification of twenty-four novel mutations in Europe and North America. Mol Genet Metab, 2003, 78:59-67.

[12] Kim SN, Ryu KH, Lee EH, et al. Molecular analysis of PCCB gene in Korean patients with propionic acidemia. Mol Genet Metab, 2002, 77:209-216.

[13] Ravn K, Chloupkova M, Christensen E, et al. High incidence of propionic acidemia in greenland is due to a prevalent mutation, 1540insCCC, in the gene for the beta-subunit of propionyl CoA carboxylase. Am J Hum Genet, 2000, 67:203-206.

[14] Ohura T, Narisawa K, Iinuma K. Mutation analysis of the propionyl-CoA carboxylase alpha-subunit gene in four Japanese patients with propionic acidaemia. J Inherit Metab Dis. 1999, 22:851-852.

[15] Richard E, Desviat LR, Pérez B, et al. Genetic heterogeneity in propionic acidemia patients with alpha-subunit defects. Identification of five novel mutations, one of them causing instability of the protein ,1999,1453:351-358.

[16] Campeau E, Dupuis L, Leclerc D, et al. Coding sequence mutations in the alpha subunit of propionyl-CoA carboxylase in patients with propionic acidemia. Mol Genet Metab,1999, 67: 11-22.

 [17] Muro S, Pérez B, Desviat LR, et al. Effect of PCCB gene mutations on the heteromeric and homomeric assembly of propionyl-CoA carboxylase. Mol Genet Metab, 2001, 74:476-483.

表1   PCCA基因编码区PCR扩增正反引物序列

外显子

正向引物

反向引物

1

GGGCATCGGGTTTCTGGCTC

GAGGGAGGAAAGCAAGCGGTGTA

2

TCGCTAGAACCTAACTGGAAG

CCCACAATGAAAAACAGAATAC

3-4

GTTATATTCAGTGTTGATGTTGG

GTGATACTGTCGTTTTGCTT

5

TTCCTGAGTTTATTTGTTGC

TTTCAATCATTCTTTCCTATTT

6

GGGCTCTTGAACAGTAAATA

AAAACCACTTCACTTGTCAC

7

ATACACATATGGGCTTTTCTTTTA

ATACATGTATGTATGTGCGTGCAT

8

GAATGAAAAGGGTTAGAAGGTAG

CAGAGCAACAAGTAATCAAAATC

9

TACTTTCCTGGTGTTATTTTCC

ATTTCAATCTTTTTCCCATTC

10

AGTCTGACTCTTCTTCTCCTTC

GCACAACTCACAATCATTCTA

11

TTACTCGTTGTATTTGAAAGGTG

GCGTCAGTGAATGATGAATG

12

TGTAATGCACACAAAAGATAAC

CATGGAGAGGAATAAATAACAG

13

TTGTGATTTTTCTTGTTTGTTTC

TTTAACCAATGCTCTGTTGC

14

ACCATATGTTGAAAATAGACCTA

GAACACCACAAAATACTGAA

15

TTTAGATTGTTTTCCTATTTTCC

CTTTCACATTTACATCAGTGC

16

TCGAGATATATTTAGAAATCTGTTAT[2]

TCGAGATATATTTAGAAATCTGTTAT[2]

17

AAGGAAATAAGTAATCTTGAATGG

AAATCATGAATGTAAACAGTCTTG

18

TAGGAGAGAAGCACAGATGTTA

CTTCTCCAAAGACCCATAAG

19

TGTTTAAAATGTTCGCAAATAC

TACTACAAATTCAAAAGACGAGAG

20

GCAGTAAACATGACAGGTTG

AATACAGCTTTTCCCTCCTA

21

TTGGCTATCGTGAACATTACATAC

ATGGTGAAACCTCATCTTTAGAAA

22

CAATTGAGAACCATTTGAAT

GTCGGTTAAGTAAGAACTGC

23

GACACATATTTTGGGGCATTTG

TGTAGAAGCGAGGGGGAGAG

24

GACAGAGGAGACGGGAAAGG

AAGGATCACAAAGAAATGCTGGTA

注：正、反向引物序列方向均为5’端到3’端

表2   9例PA患儿PCCA和PCCB基因突变检测结果

基因

病例

突变1

突变2

外显子

碱基突变

氨基酸

改变

外显子

碱基突变

氨基酸改变

PCCA

1

3

229 C>T

R77W

21

1850T>Ca

L617P

2

13

1079T>Ga

V360G

？

3

13

1102G>Ca

D368H

21

1850T>Ca

L617P

4

13

1118T>A

M373K

21

1863delAa

5

22

2002G>A

G668R

10

716-2A>G

6

22

2002G>A

G668R

？

PCCB

7

1

167-179del13ins1a

1

167-179del13ins1a

8

1

167-179del13ins1a

1

167-179del13ins1a

9

5

484G>Aa

G162R

5

484G>Aa

G162R

10

6

560-561delCCinsAa

6

601G>Aa

A201P

11

12

1253C>Ta

A418V

？

注：a为新发现突变类型

图1~13   PA患儿13种基因突变图（箭头所示为突变位置）

图1 例1 PCCA基因229C>T；图2 例2 PCCA基因1079T>C；图3 例3 PCCA基因1102G>C；图4 例4 PCCA基因1118T>A；图5 例1和例3 PCCA基因 1850T>C；图6 例4 PCCA基因1863delA；图7 例5和例6 PCCA基因2002G>A；图8 例5 PCCA基因716-2A>G；图9 例7和例8 PCCB基因167-179del13ins1；图10 例9 PCCB基因484G>A；图11 例10 PCCB基因560-561delCCinsA[反向测序]；图12 例10 PCCB 基因601G>A [反向测序]；图13 例11 PCCB基因1253C>T