韩连书

酪氨酸血症I型(tyrosinemla type I)是由于肝、肾组织中酪氨酸代谢的终末酶富马酰乙酰乙酸水解酶缺（Fumarylacetoacetase，FAH)缺陷，导致酪氨酸代障碍所致的一种遗传代谢病（酪氨酸代谢途径见图1），又称肝肾型酪氨酸血症，属于常染色体隐性遗传，本病发病率约为1/2 000至1/100 000[1]。多数患儿为急性型，起病于新生儿或婴儿期，以肝脏受累显著。少数为晚发型，患儿通常起病于1岁以后，以生长发育迟缓、进行性肝硬化、肾小管功能受损、低磷性佝偻病等为主要表现。近几年随着串联质谱和气相色谱-质谱的应用，有关酪氨酸血症I型报道越来越多，但由于引起肝病的其他代谢病如Citrin蛋白缺乏症、半乳糖血症等，也可引起血酪氨酸增高及尿中酪氨酸代谢产物增高，故两者较难鉴别，常引起误诊。酪氨酸血症I型患者血和尿琥珀酰丙酮增高[1,2]，后2种疾病血和尿琥珀酰丙酮正常。通过总结我科于2003～2010诊断的11例酪氨酸血症I型患者临床及实验室资料，探讨血尿琥珀酰丙酮检测在酪氨酸血症-I型诊断中的价值。上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书对象与方法一、对象临床表现为肝肿大，血酪氨酸增高的190例患儿。其中男103例，女87例；年龄均值8个月（3天-14岁）。二、方法1.常规实验室检测：血、尿常规检查、肝肾功能、血气分析、血糖、血氨、血乳酸、血钙磷镁、肝脏B超及肝脏核磁共振等。2.血氨基酸、酰基肉碱检测：采用干血滤纸片法串联质谱技术进行检测，具体方法见参考文献[3]。3.血琥珀酰丙酮检测：采用干血滤纸片法串联质谱技术进行检测，参考文献[4]，取直径为3 mm的疑似酪氨酸血症患者的干血滤纸片于96孔过滤板内，每孔加入100 µl 80%乙腈（含琥珀酰丙酮内标及水合肼），65 ℃孵育30 min，过滤至另一96孔板，氮气吹干后每孔加入100 µl甲醇，5 min后氮气吹干，每孔加入80%乙腈100µl，取20µl进行串联质谱检测。由美国疾病控制中心提供琥珀酰丙酮质控干血滤纸片作为质控样品。取5个不同浓度 (0、5、10、25及50 µmol/L)的琥珀酰丙酮标准品干血滤纸片进行方法准确性验证，其回收率分别为90%、95%、92%、96%及95%。参考值上下限为1600例健康儿童血琥珀酰丙酮的第99和1百分位。4.尿有机酸和琥珀酰丙酮检测：尿有机酸和琥珀酰丙酮采用气相色谱-质谱法进行检测，具体方法见参考文献[5]。5. 酪氨酸血症I型诊断依据：⑴临床表现：肝肿大，伴或不伴有黄疸；⑵血酪氨酸增高；⑶血或尿琥珀酰丙酮增高，见参考文献[1]。结 果根据诊断标准，在190例血酪氨酸水平增高患儿中确诊11例酪氨酸血症-I型患儿，其中男9例，女2例，年龄2个月～6岁，小于1岁6例，均无家族史。9例患儿已经死亡，2例存活一、 患者临床及常规实验室检测结果患者临床表现及肝功能见表1，所有患儿均伴有肝肿大，7例患儿伴有皮肤黄染。实验室检查显示，所有患儿均出现胆汁酸、碱性磷酸酶、g－谷氨酰转肽酶及甲胎蛋白显著增高，部分患儿谷氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶及胆红素增高。肾功能、血糖及钙、磷、镁水平均正常。1 例患儿肝核磁共振显示多发结节，病理活检结果为纤维化结节，非癌变。表1 11例患者主要临床表现及肝功能例号临床表现肝脏肋下（cm)甲胎蛋白碱性磷酸酶谷氨酸转氨酶天冬氨酸转氨酶g－谷氨酰转肽酶总胆红素直接胆红素1腹胀，肝大1年余3.029.4956.0210.0357.0642.018.57.22皮肤黄染3个月4.062.4792.0320.0450.0253.040.228.63腹胀半年4.545.41043.0245.0472.0526.012.37.24腹胀，肝大2年余3.025.41210.0142.0189.0241.016.98.35肝脾大10天3.084.4835.025.088.0135.037.116.16皮肤黄染、腹胀1年余2.035.41023.0231.0354.0112.021.26.47腹泻1周，腹围增大3天3.511.2782.012.034.0546.014.35.28皮肤黄染2个月5.535.41024.041.012.0137.032.722.29肝大、腹胀1个月5.089.4963.0136.0215.0312.029.618.910腹泻1周，腹围增大3天4.5126.01250.033.0153.0286.047.423.811皮肤黄染5个月5.056.9694.069.0466.0426.038.527.2中位数4.045.4963.0136.0215.0286.029.616.1注：参考值及单位, 甲胎蛋白:0～0.03mg/L; 碱性磷酸酶:200～350 U/L; 谷氨酸转氨酶:0～75 U/L; 天冬氨酸转氨酶:10～42 U/L; g－谷氨酰转肽酶:16～73 U/L; 总胆红素:3.5～20 mmol/L; 直接胆红素:0～6.8 mmol/L; 胆汁酸: 0～10 mmol/L二、 血氨基酸、酰基肉碱、琥珀酰丙酮及尿有机酸检测结果见表2。所有患者血酪氨酸水平增高，苯丙氨酸水平正常，血琥珀酰丙酮水平均增高，但在7例做过尿气相色谱-质谱检测的患儿中仅4例尿琥珀酰丙酮增高，3例未检测出。这7例患儿尿4-羟基苯乙酸、4-羟基苯乳酸及4-羟基苯丙酮酸均显著高于参考上限值。表2 酪氨酸血症型-I型患者血酪氨酸、苯丙氨酸、琥珀酰丙酮、尿琥珀酰丙酮及有机酸检测结果例号血 尿（检测值与17烷酸的比值）酪氨酸苯丙氨酸酪氨酸/苯丙氨酸琥珀酰丙酮琥珀酰丙酮4-羟基苯乙酸4-羟基苯乳酸4-羟基苯丙酮酸1255.4103.22.57.8————2419.865.36.47.2————3447.486.25.210.5————4453.592.34.97.3————5234.170.23.310.166.2258.41281.4211.16190.363.73.031.10196.5607.637.17543.371.67.621.332.4194.62191.8482.28324.6106.23.117.0165.6354.41504.81275.09201.155.53.613.4110.1192.72245.9176.410295.756.55.29.50173.8881.0469.911154.756.52.717.4068.147.335.2中位数295.770.23.610.532.4194.61281.4211.1注：①参考值分别为：酪氨酸：20～100 mmol/L；苯丙氨酸：20～120 mmol/L；酪氨酸/苯丙氨酸：0.5～2.0；血琥珀酰丙酮：0.5～5.0 mmol/L；尿琥珀酰丙酮：0；4-羟基苯乙酸：8～75；4-羟基苯乳酸：0～7.0；4-羟基苯丙酮酸：0～1.0②“-”表示未检测讨 论酪氨酸症I型主要是由于富马酰乙酰乙酸水解酶活性降低或缺失，导致酪氨酸代谢途径的终端代谢发生障碍，富马酰乙酰乙酸增高，其上游代谢物酪氨酸、4-羟基苯丙酮酸增多，旁路代谢产物4-羟基苯乳酸、4-羟基苯乙酸；中间代谢产物马来酰乙酰乙酸、富马酰乙酰乙酸增高，导致其旁路代谢产物琥珀酰乙酰乙酸、琥珀酰丙酮增高。琥珀酰乙酰乙酸、琥珀酰丙酮可与蛋白质的巯基结合，是造成肝、肾损害的主要原因。根据发病年龄，临床将酪氨酸血症I型分为急性型(发病年龄<6个月)、亚急性型(发病年龄6个月～2岁)及慢性型(发病年龄>2岁)[6]。急性型多在新生儿期起病，病情进展迅速，早期症状类似于新生儿肝炎，如呕吐、腹泻、嗜睡、生长迟缓、肝脾肿大、水肿、黄疸、贫血、血小板减少和出血症状等，常在3～9月龄时死于肝功能衰竭。晚发型通常在1岁以后发病，以生长发育迟缓、进行件肝硬化和肾小管功能受损如低磷性佝偻病、糖尿、蛋白尿以及氨基酸尿等，类似Fanconi综合征表现。此病肝肿瘤发生率较高，约30%患儿在3岁内并发肝肿瘤，主要是小细胞肝癌。约40％患儿在病程中会有急性末梢神经受累危象发生，表现为易激惹，疼痛性感觉异常，躯干与颈部过度伸展，同时伴有自主神经异常症状，如血压增高、心动过速和肠麻痹等。大部分未治疗患儿在l0岁以内死亡。故早期诊断及早期治疗是本病预后好差的关键。本组11例均表现为肝损害，1例出现肝内结节，未发现肾脏及心脏损害。4例为急性型，4例为亚急性型，3例为慢性型。9例已经死亡，2例存活，提示此病预后不良。酪氨酸血症I型由于临床表现不具有特异性，确诊需要依据特殊的实验室检测，包括血氨基酸、琥珀酰丙酮及甲胎蛋白检测,尿4-羟基苯丙酮酸、4-羟基苯乙酸及4-羟基苯乳酸及琥珀酰丙酮检测,富马酰乙酰乙酸水解酶基因或酶活性检测。由于其他疾病引起的肝脏损害如半乳糖血症、Citrin蛋白缺乏症等，也可导致血酪氨酸、甲胎蛋白增高[7]，尿4-羟基苯丙酮酸、4-羟基苯乙酸及4-羟基苯乳酸水平增高，故不能仅凭血酪氨酸或尿4-羟基苯丙酮酸、4-羟基苯乙酸及4-羟基苯乳酸水平增高诊断酪氨酸血症-I型。已有多项研究证实血或尿琥珀酰丙酮增高是诊断酪氨酸血症-I型的重要依据，另外，Matern等[8]通过对21万余例新生儿筛查 6000余例酪氨酸增高的新生儿，检测血琥珀酰丙酮，无1例增高。确诊为酪氨酸血症-I型的56例血琥珀酰丙酮均增高，其中16例（28%）血酪氨酸水平正常[8]。Al-Dirbashi等[9]通过利用琥珀酰丙酮检测进行新生儿酪氨酸血症-I型筛查，发现一部分患儿新生儿早期酪氨酸水平正常，提示通过酪氨酸水平检测进行新生儿筛查，可导致假阳性或假阴性，利用琥珀酰丙酮检测可降低假阳性或假阴性。故已有多个国家将检测血琥珀酰丙酮作为新生儿筛查酪氨酸血症-I型的指标[8-11]。本组11例血琥珀酰丙酮均增高，7例尿气相色谱-质谱检测中只有4例琥珀酰丙酮增高，提示尿气相色谱-质谱气相色谱-质谱检测琥珀酰丙酮可能出现假阴性。Al-Dirbashi等[12]建立利用串联质谱检测尿琥珀酰丙酮的方法，对15例确诊酪为氨酸血症-I型患者尿进行检测，琥珀酰丙酮均显著增高，说明气相色谱-质谱检测尿琥珀酰丙酮可因为检测前处理方法原因导致假阴性。国内已有4篇关于酪氨酸血症-I型的报道[13-16],只有1篇报道是由尿琥珀酰丙酮增高确诊[15]，其他3篇报道是依据血酪氨酸增高、尿4-羟基苯乙酸、4-羟基苯乳酸及4-羟基苯丙酮酸增高，结合临床及其他实验室结果进行诊断。根据酪氨酸的代谢途径，这些病例也可能是酪氨酸血症-II型或III型、Citrin蛋白缺乏症或继发于肝功能损伤等,因为这些疾病也可以导致上述异常，能否确诊为酪氨酸血症-I型值得探讨。故对于临床及其他检测结果提示酪氨酸血症-I型的患者，除通过气相色谱-质谱检测尿有机酸及琥珀酰丙酮外，需要同时检测血琥珀酰丙酮，以便提高酪氨酸血症-I型的确诊率，避免假阴性。酪氨酸血症I型是一种可治性遗传代谢病，主要治疗方法是控制天然蛋白质摄入、给予不含苯丙氨酸、酪氨酸配方营养粉饮食治疗及尼替西农（nitisinone）药物治疗。饮食治疗的目的是减少酪氨酸的摄入及产生，从而降低旁路代谢产物的水平。天然蛋白质摄入量需控制在1～1.5g/Kg.d，不含苯丙氨酸、酪氨酸配方营养粉用量为1.5～2.0/Kg.d。尼替西农是一种4-羟苯丙酮酸二氧化酶抑制剂，可抑制酪氨酸转变为4-羟苯丙酮酸，从而使下游代谢产物马来酰乙酰乙酸、富马酰乙酰乙酸及其旁路代谢产物琥珀酰丙酮生成减少，起到治疗作用。此药于1992年开始应用于临床，至今多个国家的应用报道显示，对肝脏、肾脏及心脏功能损害均有显著的效果[17,18]。初始剂量为1mg/Kg.d，分2～３次口服。由于尼替西龙抑制了酪氨酸向4-羟苯丙酮酸的代谢，故血酪氨酸增高，若血酪氨酸水平超过500mmol/L，需要控制天然蛋白质摄入，给予不含苯丙氨酸、酪氨酸配方营养粉饮食治疗。否则会由于血酪氨酸水平过高导致角膜损伤。

(发表在：中华围产医学杂志，2012,(8):427-432)【摘要】 目的 分析枫糖尿病（maple syrup urine disease，MSUD）患者家系基因突变情况以及对产前诊断的作用。方法 利用聚合酶链反应技术扩增BCKDHA、BCKDHB基因外显子编码区序列，直接测序分析BCKDHA、BCKDHB基因突变情况。在患儿母亲再次妊娠16～20周时抽取羊水细胞，对培养后的羊水细胞进行相应基因突变检测，用于产前诊断。 结果 4例患儿中共检测到6种不同的基因突变，包括4种新突变（c.308T>C、 c.562G>T， c.1279C>G，c.1280-1291del12）。其中在3个家系的BCKDHA基因上检测到5种突变(c.308T>C、 c.562G>T、c.868G>A、c.1279C>G及c.1280-1291del12) ，另一个家系在BCKDHB基因上检测到c.853C>T 1个突变。4例患儿母亲再次妊娠羊水细胞中毎例都检测到1个先证者携带的突变，提示胎儿为MSUD杂合子。结论 通过家系BCKDHA、BCKDHB基因分析，初步了解MSUD患者的基因突变情况，并成功应用于产前诊断，为MSUD家庭提供帮助。上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书【关键词】枫糖尿病；BCKDHA基因；BCKDHB基因；产前诊断Analysis of the gene mutations and prenatal diagnosis in the families with maple syrup urine disease Yang Nan*, Zhang Li-qin#, Han Lian-shu, Ye Jun，Qiu Wen-juan，Zhang Hui-wen, Gong Zhu-wen, Zhang Ya-fen, Zhu Jian-xing，Gu Xue-fan. *Department of Pediatric Endocrinology, Genetic and Metabolic Disease, Shanghai Institute of Pediatric Research, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200092, China. # Qingdao city women and children's health care center, Qingdao 266011,ChinaCorresponding author: Han Lian-shu, Email: xhhanlianshu@Yahoo.com.cnYan Nan and Zhang Li-qin are the first authors who contributed equally to the artical.【Abstract】 Objective Maple syrup urine disease(MSUD) is a rare metabolic disorder caused by a deficiency of the activity of the branched-chain 2-keto acid dehydrogenase complex. The complex contains the E1α, E1β and E2 subunits which are encoded by the BCKDHA, BCKDHB or DBT genes respectively. Mutation in any gene causes maple urine disease. The aim of this study was to analyze the gene　mutations of four cases with MSUD and carry out prenatal diagnosis for these 4 families. Methods The coding regions of BCKDHA gene and BCKDHB gene were amplified by polymerase chain reaction and analyzed by direct DNA sequencing. During 16 to 20 weeks of pregnancy，the amniotic fluid of each patient's mother was drawn out. The gene mutations carried by probands were analyzed after the amniocytes were cultured. Results Mutation analysis revealed six variants in four probands, including four novel mutations and two previously reported mutations. Four missense mutations(c.308T>C, c.562G>T, c.868G>A and c.1279C>G) and one deletion were detected on BCKDHA gene in 3 patients. While one nonsense mutation(c.853C>T) was found on BCKDHB gene in one patient. Only one gene mutation carried by each proband were found in the amniocytes of these four patients' mother respectively. The results indicated that these fetuses were MSUD heterozygous. Conclusion Through the analysis of the gene mutations, the mutations of 4 families were known, and were applied on the prenatal diagnosis for these families. This was help to have a healthy child for the families with MSUD.【Keywords】maple syrup urine disease; BCKDHA gene; BCKDHB gene; prenatal diagnosis枫糖尿病（maple syrup urine disease，MSUD，OMIM 248600）是一种支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）代谢紊乱疾病，属于常染色体隐性遗传病，是由于支链α-酮酸脱氢酶复合体（branched-chain α-keto acid dehydrogenase complex，BCKD）活性降低导致的一种罕见疾病,总体患病率约为1︰185 000[1]，但在门诺派教徒人群患病率较高为1︰380[2]。此复合体由支链α酮酸脱羧酶(E1a)、b支链酮酸脱羧酶( E1b)和双氢脂酰转环酶（E2）亚单位组成，其编码基因分别为BCKDHA, BCKDHB 及 DBT,其中任何一个基因发生突变都会导致此病。由于BCKD酶活性降低，E1a受阻，造成支链氨基酸和支链α-酮酸积聚在体内，对脑组织产生神经毒性作用，导致进行性神经退化性病变。BCKD是由E1α、E2、特异性激酶和特异性磷酸酶组成的立方体结构，由6条基因的编码产物构成。根据基因突变MSUD分为Ⅰa型(OMIM 608348) (编码E1α亚基的BCKDHA基因突变)、Ⅰb型(OMIM 248611) (编码E1β亚基的BCKDHB基因突变)、Ⅱ型(OMIM 248610) (编码E2亚基的DBT基因突变)，Ⅲ型(OMIM 238331) (编码E3亚基的DLD基因突变)[1]，Ⅳ型和Ⅴ型分别为特异性激酶和磷酸酶基因突变型。迄今有关BCKDHA、BCKDHB、DBT的基因突变报道已有150余种，E3基因突变报道较少。本研究对4例中国MSUD患儿及其父母进行BCKDHA、BCKDHB、DBT基因突变检测，并对这4个家系进行产前诊断。资料与方法一、 研究对象及诊断标准MSUD患儿4例，男2例，女2例，发病年龄分别为生后2、5、10和26 d，发病日期分别为2005年3月17日、2010年8月2日、2005年10月24日、2008年6月23日。1例家系父母为近亲婚配，其余3例家系父母非近亲婚配。诊断标准：（1）病时喂养困难、嗜睡、肌张力异常、抽搐、尿中焦糖样异味等；（2）血串联质谱检测亮氨酸（正常值50~300 μmol/L）、缬氨酸增高（正常值60～250 μmol/L）及尿检测多种a-酮酸增高；（3）基因检测发现突变位点[1]。这4例患儿母亲再次妊娠时，要求进行产前诊断。签署知情同意书后行家系基因突变分析和产前诊断。二、研究方法1.外周血白细胞采集:征得患儿家长同意后，取患儿及其父母外周静脉血，分离白细胞，提取DNA。2.羊水细胞采集及培养:患儿母亲再次妊娠（均是与同一配偶妊娠）16～20周时经羊膜腔穿刺术抽取羊水20 ml，取2 ml用于气相色谱质谱检测支链α-酮酸，其余羊水添加培养因子及20%胎牛血清培养2～3周后，收集细胞进行BCKDHA及BCKDHB基因突变检测。3．KDHA、BCKDHB基因检测:首先对患儿和其父母基因组DNA进行基因检测，然后对羊水细胞进行相应突变检测。BCKDHA基因包含9个外显子，BCKDHB基因包含10个外显子，应用Primier 5.0软件参照文献[3]对BCKDHA基因和BCKDHB基因编码区分别设计了9对和10对引物。扩增反应体系为50 ml：包含200 ng基因组DNA、5 ml dNTPs（1.25 mmol/L）、1 ml引物（12.5 mmol/L）、5 ml 10×TaqDNA聚合酶缓冲液、1 mlTaqDNA聚合酶、加灭菌蒸馏水至终体积50 ml。反应条件如下：95℃预变性1 min，95℃变性30 s，56～60℃退火30 s，72℃ 45 s进行34个循环，72℃再延伸10 min。经纯化后进行DNA测序（ABI377测序仪，上海生工生物公司）。测序结果采用Chromas软件分析，并与GenBank人类BCKDHA基因（NM_000709）、BCKDHB基因（NM_000056）进行比较，突变外显子均行双向测序。结 果一、 临床资料4例患儿均在新生儿期发病，临床表现为经典型，主要有呕吐、嗜睡、纳差、惊厥、肌张力增高、喂养困难等症状，其中2例患儿头颅磁共振检查发现脑内广泛异常信号影。4例患儿对维生素B1治疗均无反应，只能用不含亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸营养粉治疗。4例患儿中1例诊断后不久未及时治疗死亡，余3例进行了治疗，1例依从性较差，间断治疗，2例依从性较好，坚持治疗并定期随访。发病后即开始随访，随访时间1~6年，治疗后的3例患儿仍有智力落后、运动发育迟缓等表现，其中间断治疗的患儿智力落后更严重，表现为不会说话、运动障碍。。表1 4例枫糖尿病患儿临床资料家系编号发病年龄（d）发病时表现随访时间随访结果智力测试头颅磁共振110喂养困难、嗜睡、肌张力高、尿异味2005-10-27~2012-01-016岁，不会说话Wechsler评分47分脑干、大脑脚、基底节异常信号22反应差、抽搐、尿异味2008-11-15~2012-01-016岁，智力落后Wechsler评分54分未做326嗜睡、昏迷、尿异味2008-05-28~2008-07-021月龄死亡--未做46喂养困难、嗜睡、肌张力高2010-08-12~2012-01-0114月不会坐Gesell评分<60分脑水肿、侧脑室增大表2 4例枫糖尿病患儿血串联质谱及尿气相色谱质谱检测结果家系编号血串联质谱检测结果尿气相色谱质谱检测结果a亮氨酸(mmol/L)缬氨酸 (mmol/L)亮氨酸/苯丙氨酸2-羟基异戊酸2-酮异戊酸2-酮-3-甲基戊酸2-酮-异己酸乙酰甘氨酸19994971636258295889549221321082273669515135617632464411760279837628441073573254791664697368参考值50~30060~250<1.600<0.100<0.1注：a为检测物离子强度与内标17－烷酸离子强度的比值二、BCKDHA、BCKDHB基因检测结果4个家系的基因检测结果见图1及表2。1号家系患儿仅检测到1个BCKDHA基因突变，且羊水细胞检测到1个相同的突变，未检测到其他突变；其余3个家系患者均检测到2个突变，羊水细胞均检测到1个突变。患儿母亲再次妊娠羊水细胞中分别检测到1个先证者携带的突变，提示胎儿为MSUD杂合子。家系2和3的突变均发生在BCKDHA基因上，家系4的突变发生在BCKDHB基因上。另外，2号家系患儿、父亲和胎儿携带多态性位点c.972 C>T(F324F)[4]、c.1221A>G(L407L)(HGVbase SNP000008700)均为同义突变。图1 4例家系患儿基因突变检测结果 ①②为3号家系患儿检测到的2个杂合突变；③为1号家系患儿检测到的1个杂合突变，图示为反向测序图谱；④⑤为2号家系患儿所检测到的2个杂合突变；⑥为4号家系患儿所检测到的1个纯合突变表3 4例 MSUD患儿家系BCKDHA、BCKDHB基因突变检测结果家系成员基因突变1突变2纯合或杂合1患儿BDKDHAc.868G>A(G290R)未发现杂合突变父亲BDKDHA未发现--母亲BDKDHAc.868G>A(G290R)-杂合突变胎儿BDKDHAc.868G>A(G290R)-杂合突变2患儿BDKDHAc.1279C>G(L427V)c.1280-1291del12杂合突变父亲BDKDHAc.1280-1291del12-杂合突变母亲BDKDHAc.1279C>G(L427V)-杂合突变胎儿BDKDHAc.1279C>G(L427V)-杂合突变3患儿BDKDHAc.308 T>C(103P)c.562 G>T(G188W)杂合突变父亲BDKDHAc.562 G>T(G188W)-杂合突变母亲BDKDHAc.308 T>C(103P)-杂合突变胎儿BDKDHAc.562 G>T(G188W)-杂合突变4患儿BCKDHBc.853C>T(R285X)c.853C>T(R285X)纯合突变父亲BCKDHBc.853C>T(R285X)-杂合突变母亲BCKDHBc.853C>T(R285X)-杂合突变胎儿BCKDHBc.853C>T(R285X)-杂合突变注: -为检测对象未发现第2个突变。讨 论MSUD根据发病时间和病情进展情况分为5型：（1）经典型；（2）中间型；（3）间歇型；（4）维生素B1有效型；（5）二氢硫辛酰胺酰基脱氢酶缺乏型。本研究4例患儿均于新生儿期出现嗜睡、喂养困难、尿异味等症状，并出现惊厥、肌张力增高等神经系统症状，其中1例患儿1月龄时因难治性酸中毒死亡。综合以上特点，可明确该4例患者均为经典型。由于经典型MSUD患者新生儿期常出现反应差、嗜睡等非特异性症状，因此对疑似患者应及时进行血、尿氨基酸检测以便早期诊断。本科室曾报道利用串联质谱联合气相色谱-质谱技术检测诊断该病[5]。本研究4例患者在新生儿期即通过血串联质谱及尿气相色谱质谱检测得以诊断。患儿血中亮氨酸显著增高，最高水平达正常参考值上限8倍以上；缬氨酸和亮氨酸/苯丙氨酸比值亦明显增高。尿气相色谱质谱检测尿中α-酮酸发现，尿中2-羟基异戊酸、2-酮异戊酸、乙酰乙酸、2-酮-3-甲基戊酸、2-酮-异己酸及乙酰甘氨酸显著高于正常参考值。经典型MSUD需要早期治疗，强调诊断后立即干预，从而改善其预后。本研究中，1例患者于新生儿期死亡，1例患儿因家长放弃治疗，智力严重落后，余2例治疗依从性较好，但仍出现智力落后、运动发育迟缓等神经系统损害表现，可能与胎儿期及新生儿期中枢神经系统受损有关。故对于新生儿期无明确原因出现神经系统异常者，需要尽快进行血串联质谱及尿气相色谱质谱检测，以便早期诊断早期治疗。由于MSUD是致死、致残的遗传性疾病，患者治疗困难，且预后不良。对于有生育患儿风险的夫妇进行产前诊断，是防止MSUD患儿出生的重要手段。通过对MSUD先证者进行基因诊断，再为先证者母亲妊娠后进行产前诊断，可提高产前诊断的准确性。有关MSUD基因突变研究，目前已报道150余种 [6]，不同种族存在不同的热点突变。发病率最高的门诺派教徒社区最常见突变为BCKDHA基因c.1312T>A(p.Y393N)，该突变预计携带率高达10%[2]；也有报道其他源自同一祖先的非门诺派教徒人群常见突变为c.1312T>A (p.Y393N)[7]。葡萄牙报道在吉普赛社区BCKDHA基因热点突变为c.117delC(p.R40GfsX23)[8]。亚洲人群中，韩国报道了3例MSUD患者5个位于BCKDHA基因上的突变[9]；泰国有1例BCKDHA基因产前诊断的报道[10]，胎儿及父母携带c.529C>T(p.Q177X)无义杂合突变；中国地区尚未检索到有相关突变类型和频率的报道。本报道4例患儿中的1号、2号、3号家系患者基因突变存在于BCKDHA上，确诊为MSUDⅠa型，4号家系患者基因突变存在于BCKDHB上，确诊为MSUDⅠb型。BCKDHA基因上常见突变c.868G>A(p.G290R)，最初由Chuang等[11]报道1例轻型患者携带纯合突变(报道为p.G245R)，2006年Rodríguez-Pombo [12]报道2例症状较重的间歇型携带杂合突变。本研究中，1号家系携带该突变。G290-α可以保证支链α-酮酸脱氢酶复合体的环状结构的紧密结合，G290-α位于亚单位α-α’表面结合袋，推测G290R突变妨碍了α-α亚单位的结合，由此导致α2β2亚单位之间的组装错误引起酶活性下降[12]。葡萄牙人群中的热点突变c.117delC(p.R40GfsX23)引起读码框移，在下游23个密码子处出现终止密码子，形成截短蛋白，仅含61个氨基酸残基，很快从线粒体中被清除[13]。同时，由于终止密码子出现在非常靠前的位置上，所以相应的mRNA被无义介导降解清除，甚至不会产生截短蛋白[14]。本研究发现的BCKDHA基因突变中，除了c.1280-1291del12突变外，c.308 T>C(p.L103P)、c.562 G>T(p.G188W)、c.868G>A(p.G290R)、c.1279C>G(p.L427V)突变均为错义突变。根据E1的晶体结构， L103-α可能在疏水核的临界位点，在这个位点上，4个环状结构通过疏水键结合在一起。该位点突变L103P可能打破疏水核的结构[15]。G188-α位于亚单位结合区，G188W突变可导致E1亚单位组装异常从而影响酶活性。3号家系患儿的基因型为c.[308 T>C(L103P))+ 562 G>T(G188W)]，出生后26 d发病，临床表型为经典型，提示这2个致病突变对酶活性影响较大。c.1279C>G（p.L427V）和c.1280-1291del12（p.L427LfsX20）发生在C-末端残基处，C-末端残基的突变影响亚基的正确组装和α2β2的自然结构形成。同时，L427-α位于亚单位结合区的延伸端，该延伸端对酶的催化中心的活性至关重要[16]。所以无论是该区域的错义突变还是缺失突变，都严重影响酶活性，与基因型c.[1279C>G(L427V)]+ [1280-1291del12(L427LfsX20)]相一致。4号家系突变位点为c.853C>T(p.R285X)。该突变为已报道突变，导致终止密码子提前出现，产生截短蛋白。4例患儿母亲再次妊娠时羊水细胞的基因检测分别找到1个先证者携带的基因突变，患儿母亲再次妊娠羊水细胞中分别检测到1个先证者携带的突变，提示胎儿为MSUD杂合子。培养后的羊水细胞排除了母源细胞污染的可能。目前尚未开展支链α-酮酸脱氢酶酶活性检测，故对MSUD患者母亲羊水细胞进行基因检测对产前诊断有重要意义。另外，羊水气相色谱质谱检测支链a-酮酸均正常，进一步排除胎儿患病的可能性。已有研究证实，利用气相色谱质谱技术检测羊水有机酸进行有机酸血症的产前诊断，方法可靠[17]。本研究通过家系BCKDHA、BCKDHB基因分析，初步了解MSUD患儿的基因突变情况，并成功应用于产前诊断，为MSUD家庭提供帮助,如胎儿为纯合子，即为患儿,需要引产。

韩连书，胡宇慧（上海交通大学医学院附属新华医院 上海市儿科医学研究所，上海 200092）Progress of Pathogenesis，Diagnosis and Therapy in Propionic Acidemia上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书 HAN Lian-Shu, HU Yu-Hu (Department of Pediatric Endocrinology and Genetic Metabolism, Shanghai Institute for Pediatric Research, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medical, Shanghai 200092, China)[摘要] 丙酸血症是一种较常见的有机酸血症，临床表现缺乏特异性，既往由于缺乏可靠的诊断方法，确诊困难，误诊率较高。随着串联质谱和气相色谱-质谱技术在遗传代谢疾病检测中的应用，越来越多的患儿得到确诊，并得到有效的治疗。近年来有关本病的发病机制、诊断和治疗成为国内外研究热点。本文就本病的发病机制和诊治研究进展作一综述。[关键词] 丙酸血症；发病机制；诊断；治疗丙酸血症（propionic acidemia, PA）是支链氨基酸和偶数链脂肪酸代谢异常的一种较常见有机酸血症，为常染色体隐性遗传病，是由于丙酰CoA酶羧化酶活性缺乏，导致体内丙酸及其代谢产物前体异常蓄积，出现一系列生化异常、神经系统和其他脏器损害症状。PA临床表现个体差异较大，多数患儿在出生后1个月内起病，典型急性期临床表现为喂养困难、反复呕吐和嗜睡等。该病患病率有种族和地区差异，美国活产婴儿为1:100 000，沙特阿拉伯国家为1:2000~1:5000，格陵兰因纽特人高达1:1000，我国没有相关的报道。随着串联质谱和气相色谱-质谱技术的应用，越来越多的PA患儿得到诊断和早期治疗，PA的发病机制与诊断治疗研究也在不断地深入。一、发病机制PA是由于催化丙酰CoA转化为甲基丙二酰CoA的丙酰CoA羧化酶活性缺乏所致。丙酰CoA羧化酶是由α、β两个亚单位组成的α6β6多聚体，两个亚单位编码基因分别为PCCA（MIM 232000）和PCCB（MIM 232050）[1]。PCCA或PCCB突变均可导致丙酰CoA羧化酶活性缺乏，进而体内丙酸及其前体丙酰CoA、甲基枸橼酸和丙酰甘氨酸等代谢产物异常增高，引起机体损伤。1．脑损伤典型的脑神经病理损伤为大脑和小脑白质海绵状改变，壳核、丘脑和基底节信号异常。Baulny等[2]对比1990年之前和之后出生的PA患儿发现，新生儿期治疗和长期治疗水平的提高明显改善了患儿生存率，但60%存活患儿IQ<75分，需要特殊教育。< font="">PA患儿脑发病机制涉及能量代谢、氧化应激和兴奋性中毒等。丙酰CoA和2-柠檬酸甲酯为公认的三羧酸循环中多种酶抑制剂。给予出生后5天的大鼠23天丙酸喂养，进行水迷宫实验发现大鼠空间认知能力损害，这种认知能力的改变可被抗氧化剂VitC逆转，同时检测大鼠海马中总抗氧化能力指标均明显降低，氧化应激参与PA神经病理学机制[3]。谷氨酸受体介导大多数兴奋性神经递质的传递，适当激活对正常的脑功能和脑发育是必需的，然而过度激活导致兴奋性中毒。神经节苷脂一方面可通过帮助生长树突来修补脑神经细胞损伤，维护大脑神经网络，另一方面可对大脑离子通道进行有效调节起信息因子的作用。丙酸可使大脑皮层和小脑内神经节苷脂减少，总神经节苷脂降低约50%[4]。最近研究表明正常情况下丙酸盐可被星形胶质细胞线粒体氧化代谢，不能被神经元氧化代谢，PA中星形胶质细胞更易受损，可能与丙酰CoA在星形胶质细胞线粒体中蓄积有关。此外，PA通过增加神经元和胶质细胞中组蛋白乙酰化改变相应细胞的基因表达而引起神经系统症状[5]。2．高血氨 反复的高血氨导致神经元细胞死亡，通过神经毒性作用造成患儿智力发育落后。有机酸血症中，蓄积的代谢产物抑制了尿素循环中氨甲酰磷酸合成酶-1的活性。N-乙酰谷氨酸为氨甲酰磷酸合成酶-1的激动剂，在给予丙酸盐的小鼠肝脏中含量减少。血氨产生增加可能与N-乙酰谷氨酸含量的减少有关，两例PA失代偿期患儿给予氨甲酰谷氨酸，N-乙酰谷氨酸的前体，口服治疗，血氨浓度在6小时内降至正常。在伴有高氨血症PA患儿中发现谷氨酰胺/谷氨酸在血浆中的含量降低，而尿素循环障碍中高血氨同时伴随谷氨酰胺浓度升高，因此PA患儿中血氨升高机制与谷氨酰胺/谷氨酸生成缺陷有关，不同于尿素循环中某种酶的缺陷所致高血氨[6]。PA患儿柠檬酸甲酯尿排泄增加，柠檬酸尿排泄减少显示有缺陷的三羧酸循环不能维持足够量的谷氨酰胺前体，导致血氨含量增加[7]。3．心肌病Baumgartner等[8]发现70%PA患儿QT间期延长，20%动态心电图检测有心律失常，40%左室心功能减弱。即使无神经系统症状、生长发育正常、长期给予低蛋白饮食治疗的轻型PA患儿也可因心肌病引起心衰和猝死[9]。对一名心衰和心室纤颤死亡的轻型PA患儿进行尸检发现，心肌明显肥大，肉碱含量降低。尽管患儿生前进行口服肉碱治疗，血浆肉碱浓度正常，心肌中总肉碱和游离肉碱浓度却显著降低，酰基肉碱降低更明显。对心肌中线粒体酶活性研究发现肉碱棕榈酰基转移酶活性正常，复合体I-III（NADH-细胞色素C还原酶）活性明显缺乏，同时中链（辛酰）酯酰CoA脱氢酶活性降低明显。推测心肌病的发生与肉碱含量降低和能量代谢损伤有关[9]。4．其它高血甘氨酸常见于PA患儿，尽管甘氨酸升高在PA发病机制中的作用不明，但血浆中甘氨酸浓度与摄入的能量负相关，与血清中碳酸氢盐的含量正相关[9] 二、诊断由于PA的临床表现缺乏特异性，临床误诊率较高，因此对于原因不明、反复发生呕吐、惊厥、难以纠正的酸中毒、昏迷和发育落后，尤其有类似家族史者应考虑到本病。对患儿及早进行血尿常规、血气分析、血氨、血乳酸、血糖和心肌酶谱等一般生化检查，并尽快留取血滤纸片进行串联质谱酰基肉碱分析，留取尿进行气相色谱－质谱有机酸分析。1. 特殊生化诊断PA患者串联质谱检测结果显示血中丙酰肉碱、丙酰肉碱与游离肉碱比值、丙酰肉碱与乙酰肉碱的比值及甘氨酸水平增高；气相色谱－质谱检测结果显示尿中有大量的甲基枸橼酸、3-羟基丙酸和丙酰甘氨酸，即可诊断。我国已有多例通过串联质谱和气相色谱－质谱检测出PA患儿的报道[10，11]。通过皮肤成纤维细胞和外周血淋巴细胞酶学分析和基因检测可确诊PA。积极开展产前诊断可减少PA患儿的出生，减轻家庭和社会的负担。2. 基因诊断 随着丙酸血症分子遗传学的研究进展，快速的基因诊断和进一步的产前诊断成为可能。PCCA突变位点主要集中在外显子13、12、19和18[1]。PCCA突变存在较大的异质性，尤其在高加索人群中，没有发现占主导的突变，而在日本人群中922-923intT、1644-6C>G和R399Q占总等位基因突变的56%[12]。PCCB突变位点多发生于外显子12、15、11和6，少数几个突变为不同人群中多数人共有。高加索人中，1218del14ins12（ins/del）最常见。1172-1173insT和E168K尤其常见于西班牙和拉丁美洲人群中[13]。T428I、R410W和A153P为日本人PA中热点突变，分别占等位基因的30%、26.7%和13.3%[12]，Yorifuji等[14]在10例轻微型PA患儿中发现8例有Y435C突变占13/16。T428I为韩国PA热点突变，约占总等位基因突变的56.3%[15]。格陵兰因纽特人多数PA患者中包含3个碱基的插入突变，1540insCCC。3. 产前诊断通过测定培养的羊水细胞或绒毛膜组织酶活性和突变基因，或羊水中甲基枸橼酸浓度可直接进行产前诊断。直到PA的遗传基因被阐明，产前诊断通过分析胎儿组织中代谢产物的量和/或酶活性才成功开展。对未受损的绒毛膜细胞或培养的羊水细胞进行酶活性和基因突变分析，结果通常在7-10天内得出，因此该产前诊断方法快速而可靠[16]。当胎儿丙酰CoA活性缺乏时，羊水中柠檬酸甲酯含量为正常的20-30倍。使用稳定同位素稀释-气相色谱质谱直接对去细胞羊水进行生化分析可用于PA产前诊断，Inoue等[17]通过对羊水进行简单的尿素酶预处理，可使该方法检测出羊水中91%±3%的柠檬酸甲酯，且仅需要0.02ml样本，共耗时1.5小时，是一高敏感、快速精确的产前诊断方法。三、治疗PA缺乏特异的治疗方法，丙酸血症急性期主要为对症治疗，以终止蛋白摄入、静脉输入葡萄糖和纠正酸中毒为主，必要时进行腹膜透析和血液透析。长期治疗以控制蛋白质饮食为主，给予不含异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸和苏氨酸的配方奶，并保证足够热量的供应，补充左旋肉碱利于丙酰辅酶A的代谢和排除。在反复出现代谢失代偿时，可考虑进行器官移植。1. 饮食限制长期治疗以限制蛋白饮食为主，但要保证足够的蛋白质和能量。PA患儿在确诊时多已伴有生长发育落后，在给予推荐量的特殊配方奶六个月治疗研究发现，患儿发育和营养状态明显改善。正常蛋白质和几种特殊氨基酸限量见表1。每日所需总蛋白质量，婴儿为2.5～3.5g/kg，儿童为30～40g，成人为50～65g，不足部分用不含缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸的配方奶，或蛋白质替代。同时避免饥饿，抑制肌肉组织和脂肪组织代谢。表1 丙酸血症患儿每日正常蛋白质摄入限量年龄 蛋白质 缬氨酸 异亮氨酸 酸苏氨酸 酸甲硫氨酸 (g/kg/d)～3月 1.2～1.8 65–105mg/kg 70–120mg/kg 50–135mg/kg 20～50mg/kg～6月 1.0–1.5 60–90 60–100 50–100 15–45～9月 0.8–1.3 35–75 50–90 40–75 10–40～12月 0.6–1.2 30–60 40–80 20–40 10–30～4岁 0.6–1.2 500–800mg/d 480–730mg/d 400–600mg/d 180–390mg/d～7岁 0.6–1.2 700–1100 600–1000 500–750 250–500～11岁 0.5–1.1 800–1250 700–1100 600–900 290–550～15岁 0.4–1.0 1000–1600 750–1300 800–1200 300–800～19岁 0.4–0.8 1100–2000 800–1500 800–1400 300–900>19岁 0.3–0.6 900–2000 900–1500 800–1500 250–10002. 口服药物（1）左旋肉碱：有利于与体内的酸性物质结合，促进酸性物质的代谢和排出，急性期：100～200mg/Kg×d，静滴；稳定期：50～100mg/Kg×d，口服。部分患儿使用后可出现轻度腹泻不良反应。（2）新霉素或甲硝唑：由于体内丙酸一部分是由肠道细菌的代谢产生吸收如血液，新霉素和甲硝唑可抑制肠道细菌的繁殖代谢，减少肠道细菌代谢产生的丙酸。用法：新霉素为50mg/kg×d，甲硝唑为10~20mg/kg×d。由于长期使用抗生素会导致肠道内菌群紊乱，所以不建议长期使用，可在急性期使用。（3）氨甲酰谷氨酸口服促肠蠕动剂明显降低血氨浓度，减少尿丙酰甘氨酸的排泄，增加游离肉碱和总肉碱含量，促肠蠕动剂可改善PA患儿代谢稳定性[18]。氨甲酰谷氨酸在PA急性失代偿期对高血氨有解毒作用，在口服6小时后血氨浓度恢复正常，可避免进一步的透析治疗。氨甲酰谷氨酸是一种安全有效的治疗药物。3. 肝移植 近几年肝移植作为一种治疗PA的方法已取得明显的进步。Barshes等对12名接受活体肝移植的PA患儿研究显示，一年内存活率为72.2%，一些病人临床症状明显改善，无需进行饮食限制和其他医学治疗[19]。辅助性原位肝移植为原位肝移植的一种，保留了患儿部分肝脏，以便将来进行基因治疗并且具有为移植失败的病例提供暂时性功能支持的优势。一名接受辅助性原位肝移植10年的患者，没有进行饮食控制和药物治疗，临床和生化指标正常，精神运动发育和智力水平接近正常[20]。由于多数PA患儿伴有严重的脑损伤，肝移植应早期并且在患儿身高>-2SD时进行。肝移植的预后与患儿身高增长延迟程度有关，身高<-2sd患儿明显较无身高落后的患儿差[21]。综上所述，虽然PA患儿临床表现严重，但随着诊断技术的提高，患者诊断的年龄越来越早，为及时的有效治疗提供了机会，患者的预后得到明显改善。且随着对PA的发病机制及诊断治疗的研究深入，必将为PA患儿提供更有效的治疗方法。 参考文献[1] Campeau.E, Desviat.L.R., Leclerc.D, et al. 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人生长激素是脑垂体前叶分泌的一种激素,是体内最重要的促进生长的激素。儿童身高的增长主要是通过长骨骨干与骨骺之间的软骨板中的细胞分裂增殖实现的, 生长激素)对软骨细胞的分裂增殖具有显著的促进作用。基因重组人生长激素应用于临床已有20多年的经验，在治疗小儿矮小症方面的疗效得到充从分肯定，其治疗适应症也逐渐扩大，主要包括如下几种疾病。上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书　　一、生长激素缺乏症（GHD）: GHD是由于各种原因导致垂体生长激素分泌不足所致的身材矮小,是儿童矮小症的主要原因，是生长激素的最佳适应症。治疗方法:开始剂量为每天0.1～0.14 IU /kg。开始治疗时间年龄宜早,生长激素对GHD患儿的促生长作用具有剂量依赖性，在治疗的前两年身高增长为10～12cm /年,随后生长速率减慢,一般保持在7～8 cm /年，若每3个月增长速度小于2cm，可增加剂量至每天0.15IU /kg。处于青春期,身材又较矮的GHD患儿可联合使用促性腺激素释放激素类似物，抑制骨龄加速，延长患儿骨骺闭合的时间，增加生长激素使用的时间，可取得更好的效果。生长激素的治疗效果与生长激素缺乏的程度、治疗开始的年龄、疗程、遗传身高及个体对生长激素的敏感性有关。　　二、特发性矮小症 : 特发性矮小症是指因目前尚无可认知的原因引起的身材矮小,包括正常变异性矮小(包括家族性矮小、体质性生长青春期延迟) 、部分生长激素不敏感等。生长激素治疗方法: 特发性矮小症患儿由于自身并不缺乏生长激素，所以使用剂量较GHD患者大，一般为每天0.15 ～0.20IU /kg,治疗 3个月观察疗效，有效者继续治疗。青春期可联合使用促性腺激素释放激素类似物，延缓性激素对骨龄的加速，延长生长激素使用时间。　　三、性早熟患者伴矮小症：性早熟患者常引起成年终身高低于遗传靶身高，尤其是矮小症患者。所以部分性早熟患者需要用生长激素治疗，剂量：每天0.15 ～0.20IU /kg,可与促性腺激素释放激素类似物联合使用，或单独使用。　　四、Turner综合征: 又称先天性卵巢发育不全,是由于全部或部分体细胞中一条X染色体完全或部分缺失或结构畸变所致,部分患者伴有生长激素缺乏。生长激素治疗方法:生长激素治疗Turner综合征原则为及时诊断,尽早治疗,年龄越小疗效越好。伴有生长激素缺乏者使用剂量同生长激素缺乏症，不伴有生长激素缺乏者，需要剂量较大：每天0.15 ～0.20IU /kg，至骨龄12岁可加用雌激素治疗。　　五、小于胎龄儿：是指出生体重或身长小于同胎龄正常小儿体重或身长的2SD以下。SGA在生后出现自发的追赶生长,多在2岁能赶上正常的同龄小儿,约10%的SGA 在儿童和成年后身高仍低于2SD，若2岁时仍矮小需要生长激素治疗。生长激素治疗方法:剂量为每天0.15～ 0.20IU/kg,追赶上正常同龄儿身高后停药观察,若停药后生长速度减慢，可继续使用生长激素治疗。　　六、Prader-Williy综合征: Prader-Williy综合征是由于父源性印迹SNRPN基因和其他一些基因缺失引起的一种综合征，表现为身材矮小、重度肥胖、肌张力低、智力发育障碍和性腺发育不良。生长激素治疗方法:剂量为每天0.15～ 0.20IU/kg,观察疗效。　　七、Noonan综合征：Noonan综合征是常染色体显性遗传病,特征为身材矮小、先天性心脏缺陷和特殊面容及体征，包括眼距宽,向下斜视,三角脸,颈蹼、短颈,低耳位,胸部畸形(胸廓狭窄或胸骨内陷) 。生长激素治疗方法:剂量为每天0.15～ 0.20IU/kg,观察疗效。　　八、特发性关节炎：最近有研究表明,接受糖皮质激素治疗幼年型关节炎患儿,使用生长激素治疗有效，与既往报道不同，故对于患特发性关节炎的矮小症患儿可试用生长激素治疗，剂量：每天0.15～ 0.20IU/kg,3个月为一疗程，有效者继续治疗。　　生长激素治疗过程中应随访观测，一般可3个月随访1次。项目包括每3个月测身高、体重、类胰岛素样结合因子-I和类胰岛素样结合因子结合蛋白-3、血糖及肝功能；甲状腺激素第一个疗程结束检测，若正常以后不需要检测。若降低，按甲减治疗随访；骨龄检测，发育前期每年测一次，青春发育期每半年1次。　　停药时间：至发育期后生长激素治疗过程中身高增长率每年不足 2 cm，骨龄男孩16岁、女孩15岁时可以停药。

甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症患儿基因突变分析 王斐 韩连书 胡宇慧 杨艳玲 叶军 邱文娟 张雅芬 高晓岚 王瑜 顾学范上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书【摘要】 目的 检测甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症患儿的MMACHC基因突变类型及突变频率。方法 依据串联质谱检测血中的酰基肉碱、气相色谱-质谱检测尿甲基丙二酸、血清同型半胱氨酸测定及维生素B12负荷试验等进行诊断；应用聚合酶链反应（PCR）对这些患儿、部分直系亲属及健康对照组的MMACHC基因外显子进行扩增，通过DNA直接测序进行基因突变分析。结果 在28例患儿中27例检测到突变，共10种，其中2例仅检测到1个杂合突变，3例仅检测到多态性。突变集中在外显子3和4上（91.3%），以609G>A（W203X）最常见，突变频率为53.6%，其中10例为纯合突变，10例为杂合突变；其次为658_660delAAG（K220del），突变频率为8.9%，均为杂合突变。另外检测到6种未报道突变，分别为1A>G、365A>T、658_del660AAG、301-3_327del 30、567_568insT和625_626insT。3种基因多态性分别为-302T>G（rs3748643）、-234A>G（rs3728644）和321G>A（rs2275276）。结论 本研究结果揭示了中国甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症患儿的部分基因突变谱，其中609G>A（W203X）可能为热点突变。【关键词】 甲基丙二酸；同型半胱氨酸；基因；突变Analysis of gene mutations in Chinese patients with Methylmalonic acidemia and homocystinemia. WANG Fei, HAN Lian-shu, HU Yu-hui, YANG Yan-ling,YE Jun, QIU Wen-juan, ZHANG Ya-fen, GAO Xiao-lan, WANG Yu, GU Xue-fan. Department of Pediatric Endocrinology and Genetic Metabolism, Shanghai Institute for Pediatric Research, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200092, ChinaCorresponding author: HAN Lian-shu（ Email: xhhanlianshu@Yahoo.com.cn）【Abstract 】 Objective Methylmalonic acidemia and homocystinemia, C type, is the most common inborn error of cobalamin metabolism. The gene MMACHC (OMIM 277400) is located on chromosome 1p34.1 with four coding exons and a 5th non-coding exon. It encodes for a protein with 282 amino acid residues. So far, more than 40 mutations have been detected, in which 271dupA(R91KfsX14) is the hot spot of MMACHC gene. However, there haven’t relative reports in China. The present study aimed to identify the mutation types of MMACHC gene and analyze the genotype-phenotype correlations in Chinese patients. Mothods The diagnosis of this disease mainly depends on the measurement of C3 (propionylcarnitine),C3/C0(free carnitine) and C3/C2(acetylcarnitine) in the blood by tandem mass spectrometry, the detection of methylmalonic acid in the urine by gas-chromatography mass spectrometry, the determination of total homocysteine in the serum, and the loading test of vitamin B12. The entire coding region of MMACHC gene was screened by polymerase chain reaction (PCR) combined with DNA direct sequencing in 28 Chinese patients. Genomic DNA was extracted using Phenol-Chloroform method from the peripheral blood leukocytes of each patient. PCR amplification products were checked by 1.8% agarosegel electrophoresis and were subsequently sequenced with both the forward and reverse primers. Mutational analyses were performed using normal human genomic MMACHC sequence as a reference (GenBank ID: 25974). Results In this study, ten mutations were identified in 27 of 28 Chinese patients. Most of them were located in exons 3 and 4(91.3%). We detected four mutations reported, which were 609G>A(W203X), 217C>T(R73X), 271dupA(R91KfsX14), and 394C>T(R132X), and six novel mutations, which were 1A>G, 365A>T, 658_660delAAG, 301-3_327del 30, 567_568insT, and 625_626insT. The 609G>A (W203X) is the most common mutation, which was detected in 30 of 56 alleles (53.6%), including 10 homozygote mutations and 10 heterozygote mutations. In addition, three gene polymorphisms were detected, namely, -302T>G (rs3748643), -234A>G(rs3728644), and 321G>A(rs2275276). These mutations include missense mutations, nonsense mutations, duplication, deletions, and insertions. Conclusion In this study, we found a part of gene mutations spectrum in Chinese patients with methylmalonic acidemia and homocystinemia, in which the 609G>A(W203X) may be the hotspot mutation of MMACHC gene. This would help for the prenatal diagnosis and gene screening programs of methylmalonic acidemia and homocystinemia.【Key words】 Methylmalonic acid; Homocystine; Gene; Mutation甲基丙二酸血症(methylmalonic acidemia)是一种常染色体隐性遗传病，主要是由于甲基丙二酰辅酶A变位酶自身缺陷或其辅酶钴胺素(Cobalamin, cbl, VitB12)代谢缺陷所致。钴胺素代谢缺陷包括cb1A、cb1B、cb1C、cb1D、cb1E、cb1F、cb1G和cb1H 8种亚型，其中cb1C、cb1D和cb1F可同时导致辅酶脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素合成障碍，引起体内甲基丙二酸及同型半胱氨酸蓄积，故称为甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症。临床表现为神经、血液、肝脏、肾脏和皮肤等多系统损伤[1]。以C型常见，其编码基因为MMACHC (OMIM 277400)，定位于染色体1p34.1，含有5个外显子，cDNA有846 bp的开放读码框，编码282个氨基酸[2]，迄今为止，已报道40余种突变，国内尚未见相关报道。我们对2003年01月~2007年12月确诊为甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症的28例患儿进行MMACHC基因突变检测，报道如下。对象和方法一、对象甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症患儿28例，14例来自本院，14例来自北京大学第一医院。患儿相互间无血缘关系，父母非近亲婚配。所有检查均获得患儿家长或监护人的知情同意。对照组为50例无血缘关系的非甲基丙二酸血症儿童。二、方法1. 诊断：（1）依据串联质谱检测患儿血中丙酰肉碱(propionylcarnitine, C3)、C3与游离肉碱（free carnitine, C0）比值和C3与乙酰肉碱(acetylcarnitine,C2)比值增高[3,4]；（2）气相色谱-质谱检测尿甲基丙二酸水平升高[5]；（3）血清同型半胱氨酸增高[6]；（4）VitB12负荷试验治疗有效[7]。同时对这些患儿进行血、尿常规、血气分析、血氨、血糖、血乳酸、肝肾功能和心肌酶谱测定、脑CT 或MRI扫描、脑电图、智测等辅助检查[6,7]。2. DNA提取：取患儿及部分患儿父母外周静脉血各4 ml，2%EDTA100μl抗凝，常规分离白细胞，采用苯酚-氯仿法提取DNA，－20°C保存。3. PCR扩增：设计MMACHC基因引物（表1），对其5个外显子、内含子及前侧翼区进行PCR扩增。PCR反应体系为50 ml，含10×buffer 5 ml，dNTPs 8 ml(1.25 mmol/L)，MgCl2 3 ml(25 mmol/L)，上下游引物(12.5 pmol/L)各2 ml，DNA模板约200 ng，Taq酶(Promaga公司) 2.5 U。在PCR仪上进行94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，56~62 ℃退火30 s~1 min，72延伸30 s~1 min，循环32～35圈后72 ℃继续延伸5 min。1.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定目的PCR产物。4. DNA测序分析：PCR产物进行纯化后在ABI 3700测序仪上测序。应用Chromas软件分析测序图谱，结合GenBank（序列号：25974）人类MMACHC基因序列来识别患儿中的突变，并对照50例正常儿童的MMACHC相关位点基因测序结果，确定新突变及基因多态性。5. 蛋白结构及同源氨基酸序列分析：根据Lerner-Ellis等[2]建立的MMACHC同源蛋白模型，对人类和其他种属的MMACHC同源序列进行比较，分析推测突变对蛋白结构功能的影响。 结 果一、患儿临床资料及辅助检查鉴于来自北京大学第一医院患儿的临床资料不全，故仅对本院14例患儿进行临床分析。其中11例患儿于1岁内起病，主要表现为喂养困难、反复呕吐、嗜睡、抽搐、智力落后、肌张力低下、精神运动发育迟缓，伴有巨幼红细胞性贫血、血小板或白细胞减少。3例患儿于1～4岁起病，表现为急性神经运动障碍，包括认知能力下降、意识模糊、运动功能倒退等。血串联质谱检测结果[中位数表示（范围）（对应参考值）]为C3：9.21（3.43～18.61）mmol/L （< 4. 0mmol/L ）；C3/C0：0.53（0.2～3.94）（<0.25）；C3/C2：1.2（0.41～2.06）（< 0.3）。尿气相色谱-质谱检测示甲基丙二酸水平（甲基丙二酸与内标17－烷酸的比值）为204.27（55.60～1032.82）（<1.1）。血清同型半胱氨酸平均为50 μmol/L（参考值5～15μmol/L）。其他检查示血红蛋白降低（13例），平均红细胞压积升高（9例），肝功异常（3例），尿微量蛋白增加（1例），提示轻度肾损伤，心肌酶谱异常（5例），部分患儿伴有酸中毒、尿酮体阳性、乳酸及血氨升高。颅脑MRI主要表现为脑萎缩、脑白质脱髓鞘病变及脑发育不全。7例患儿智测提示智力落后。11例患儿VitB12负荷试验后症状有明显改善。以上病例随访至今，2例早发型患儿于1岁内死亡。二、MMACHC基因突变检测结果及突变频率分析28例患儿的MMACHC基因突变测序分析（表2）示，等位基因突变检出率为82.1%（46/56）。27例患儿中检测到10种突变（图1～11），其中22 例检测到2个突变，检出率为78.6%（22/28），2例各检测到1个突变，3例仅检测到多态性，1例未检测出突变。突变集中在外显子3和4上，突变频率占91.3%（42/46）。在这10种突变中4种突变国外已报道，其中609G>A突变频率为53.6%（30/56），10例为基因纯合型，10例为杂合型；394C>T与609G>A以杂合型见于2例患儿；217C>T、609G>A 与271dupA、365A>T以杂合型分别见于1例患儿。另外6种突变未见报道，分别为1A>G、365A>T、658_660delAAG、301-3_327del 30、567_568insT和625_626insT，在50例正常对照组中未检测到这些突变。同时检测到3种基因多态性，即位于外显子1前侧翼序列中的-302T>G、-234A>G，以及外显子3上的一种同义突变321G>A（V107V）。参照PubMed中单核苷酸多态性数据库，证实分别为rs3748643、rs3728644和rs2275276，均为MMACHC基因多态性。三、突变序列结构分析人类MMACHC基因共编码282个氨基酸，根据MMACHC同源蛋白模型可知钴胺素结合区为残基122-156，MMACHC的C-末端为残基185-282跨越区，与TonB折叠有高度相似性。由此分析得出本研究中2种突变365A>T（H122L）及394C>T（R132X）位于钴胺素结合区；4种突变即567_568insT（I190?）、609G>A（W203X）、625_626insT（V209?）和658_660delAAG（K220del）则位于MMACHC的C-末端结构区。讨 论甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症是甲基丙二酸血症中最常见的一种类型，分为cb1C、cb1D和cb1F型，以cb1C型最常见。C、D或F缺陷一方面可造成维生素B12不能转化为脱氧腺苷钴胺素，继而使线粒体内甲基丙二酰辅酶A变位酶活性下降，引起甲基丙二酸大量堆积，导致甲基丙二酸血症；另一方面使维生素B12不能转换成甲基钴胺素，使蛋氨酸合成酶活性下降，引起体内同型半胱氨酸蓄积，伴巨幼红细胞性贫血。早发型患儿多在1岁内起病，以神经系统症状为主，常伴发血液系统及胃肠道功能障碍。迟发型患儿可在1岁后起病，常合并脑、外周神经、肝、肾、眼及血管等多系统损害，运动障碍表现突出[8-10]。近年来随着串联质谱和气相色谱-质谱技术的应用，提高了甲基丙二酸血症诊断率，许多患儿得到及时诊断。本院14例患儿主要表现为呕吐、纳差、抽搐、贫血、智力落后、四肢肌力低下及生长发育迟缓，体内甲基丙二酸及同型半胱氨酸明显蓄积。部分患儿合并巨幼红细胞性贫血、代谢性酸中毒、肝肾功能及心肌酶谱异常。颅脑MRI主要表现不同程度的脑萎缩及发育不全，智测示智力低下，脑电图示惊厥发作，均为脑损伤征象[11]。患儿对VitB12治疗均有效。随访至今，除2例早发型患儿死亡外，其余患儿病情明显好转。近几年国外已开展有关MMACHC基因型的研究。Lerner-Ellis等[2]通过对250例cb1C 型患者的基因突变研究，检测到42种突变及24种基因多态性。271dupA（R91KfsX14）突变频率达40%，主要见于欧洲人；217C>T杂合突变见于6例患者；394C>T位于热点CG岛中，主要以纯合型见于11例印第安、巴基斯坦或中东患者；609G>A纯合突变见于5例东亚患者。我们在28例患儿中也发现以上4种突变，其中609G>A突变频率为53.6%，提示为中国人群的热点突变。这4种突变在氨基酸翻译过程中都有提前终止的作用，271dupA突变导致从第91位精氨酸发生移码，在第105位密码子处提前终止[12]；217C>T、394C>T和609G>A为3种无义突变，可造成第73、132位的精氨酸及第203位的色氨酸翻译提前终止。本研究发现的6种新突变均为杂合突变，以658_660delAAG较多见，造成蛋白质翻译时第220位赖氨酸缺失；1A>G使第1位蛋氨酸变为缬氨酸，此位点有报道突变1A>T，氨基酸改变尚未确定[2]；365A>T则可使第122位组氨酸突变为亮氨酸，此位点有报道为365A>G，即组氨酸变为精氨酸[2]；301-3_327del30为30个碱基片段的缺失，造成部分内含子缺失及第93位丝氨酸到101位异亮氨酸9个氨基酸缺失；567_568insT、625_626insT分别造成从第190位异亮氨酸及209位缬氨酸开始发生移码突变。这几种新突变需要通过体外表达来进一步证实。本研究中检测到3种基因多态性，其中-302T>G 及-234A>G均位于前侧翼区，可能对基因调控起作用。3例患儿仅检测到多态性，可能由于突变发生在剪切或上游调控区中，故未检测到突变。综上所述，突变位点主要集中于外显子3及外显子4序列中，故可优先对这两个外显子区进行基因筛查。通过MMACHC蛋白结构分析可知，钴胺素结合区为122-HXXGX126-154GG-156，C-末端结构（残基185-282）为一个非连续的β-折叠以及12个残基形成的α-螺旋，与TonB存在结构功能相似性。突变271dupA（R91KfsX14）及217C>T（R73X）使翻译在钴胺素结合区之前终止，365A>T（H122L）及394C>T（R132X）则位于钴胺素结合区，都可影响钴胺素的结合；突变301-3_327del30是发生在C-末端结构之前的移码突变，567_568insT（I190?）、609G>A（W203X）、625_626insT（V209?）与658_660delAAG（K220del）则位于MMACHC的C-末端结构区中，均可能影响钴胺素转运所需的质子泵能量转化。根据MMACHC蛋白同源序列分析可知，突变365A>T、394C>T、567_568insT、625_626insT及658_660delAAG除影响以上功能结构区外，也位于同源序列的高度保守区，提示对蛋白功能的影响作用较大；而1A>G突变虽然未发生在功能结构区，但位于高度保守区，仍可能对蛋白功能有重要影响。此外，研究认为MMACHC基因突变也可能直接或间接影响钴胺素中心钴原子的还原及上游轴向配体的清除，继而影响细胞内钴胺素的运输[2]。近来对MMACHC基因型与临床表现型的研究认为两者存在一定的关系。汇总以往的报道，在282例cb1C型患者中有69例为271dupA纯合型，其中66例为早发型；394C>T是另一种常见突变，17例患者为纯合型，其中16例为迟发型，26例患者为杂合型，其中14例早发，12例迟发[2,12-14]。本研究中突变频率较高的609G>A突变的纯合型及杂合型在早发型和迟发型患儿中均检测到，271dupA及394C>T分别仅见于1例患儿，故尚不能明确突变基因型与表现型之间的关系。1例患儿未检测到突变，疑为继发性维生素B12缺乏症。综上所述，本研究表明609G>A为中国甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症患儿的热点突变，并检测到6种国内外尚未报道的突变。这些突变的检出有助于建立基因诊断筛查系统，并可进行携带者的检测及先证者家系的产前诊断[15]。至于这些突变对蛋白功能和酶活性的影响，以及基因型与临床表现型之间的关系尚有待进一步研究。 参 考 文 献[1] Thiele J, Van Raamsdonk JM. 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Mol Genet Metab, 2008,93:475-480.[15] 顾学范, 叶军. 新生儿疾病筛查. 上海:上海科学技术文献出版社. 2003：223-225.表1 MMACHC 基因PCR引物序列 外显子正向引物（5'-3'）反向引物（5'-3'）片段大小(bp)Exon 1GGGATACCGTGATGATACGCGAACCCAGGAGGATCAGAGG680Exon 2TGCATCACATAGCGTCAGTGAGCCTGGCTTTAGGGTATCA467Exon 3TCATGTTTTCCCTTCTGAGGACAAAGCTAATTTGTTCTGGGTTG395Exon 4aAGGCCTAGCTTGCAATGATGGAAGGCAGATGGGAATTCTG694Exon 4bTTTGGCAAAGCAAAAGGTTCAAGATGGGTGGATCACGA395Exon 5aAGCCTGGCCAATACAGTGAAAGCCTTCCCTTGGTTCTAGC689Exon 5bACCATTTTGGGAGGCTGAGGGGCAGGCTACTGGTTTGTA666表2 27例患儿MMACHC基因突变分析 突变位点(外显子)碱基改变氨基酸改变突变等位基因数纯合突变基因数杂合突变基因数突变频率突变类型11A>GaM1V2020.036错义突变2217C>TR73X1010.018无义突变2271dupAR91KfsX141010.018重复突变3365A>TaH122L2020.036错义突变3394C>TR132X2020.036无义突变3301-3_327del30aS93?1010.018缺失突变4609G>AW203X3020100.536无义突变4658_660delAAGaK220del5050.089缺失突变4567_568insTaI190?1010.018插入突变4625_626insTaV209?1010.018插入突变合计104620260.821注：a为国内外尚未报道的突变 图1 609G>A(纯合突变)；图2 609G>A(杂合突变)；图3 394C>T；图4 217C>T；图5 271dupA；图6 1A>G(反向测序)；图7 365A>T；图8 658_660delAAG；图9 301-3_327­­del 30；图10 567_568insT；图11 625_626insT图1~11 MMA患儿MMACHC基因突变图（箭头示突变碱基）

临床儿科杂志，2011, 29(12): 1185-1188.杨楠 韩连书 叶军 邱文娟 王瑜 季文君 高晓岚 李晓燕 金晶 顾学范 上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书上海交通大学医学院附属新华医院,上海市儿科医学研究所,内分泌、遗传代谢病研究室酪氨酸血症I型(Tyrosinemia type I)是由于肝、肾组织中酪氨酸代谢的终末酶富马酰乙酰乙酸水解酶（Fumarylacetoacetase，FAH)缺陷，导致酪氨酸代谢障碍所致的一种遗传代谢病，又称肝肾型酪氨酸血症，属于常染色体隐性遗传，本病患病率约为1/2 000至1/100 000[1]。多数患儿为急性型，起病于新生儿或婴儿期，以肝脏受累显著。少数为晚发型，患儿通常起病于1岁以后，以生长发育迟缓、进行性肝硬化、肾小管功能受损、低磷性佝偻病等为主要表现[1]。近几年随着串联质谱和气相质谱的应用，有关酪氨酸血症I型的报道越来越多[2]。尼替西农的应用为酪氨酸血症-I提供了有效的治疗方法[3]。本文通过总结我科尼替西农治疗2例患儿的经验，结合文献复习，探讨尼替西农对酪氨酸血症I型的疗效。1 对象与方法1.1 对象对190例临床疑似酪氨酸血症患儿经串联质谱检测血酪氨酸水平增高者，进行血串联质谱和尿气相色谱琥珀酰丙酮检测，确诊酪氨酸血症-I型患儿11例，男9例，女2例，年龄2个月～6岁，小于1岁6例，其中2例进行了尼替西农治疗。1.2 方法1.2.1 常规实验室检测：血、尿常规检查、肝肾功能、血气分析、血糖、血氨、血乳酸、血钙磷镁、甲胎蛋白、肝脏B超及肝脏核磁共振等。1.2.2 血氨基酸、酰基肉碱检测：血氨基酸、酰基肉碱检测采用干血滤纸片法串联质谱检测，具体方法见参考文献[4]。1.2.3 血琥珀酰丙酮检测：血琥珀酰丙酮检测采用干血滤纸片法串联质谱进行检测，参考文献[5]，取直径为3mm的疑似酪氨酸血症患者的干血滤纸片于96孔过滤板内，每孔加入100µl 80%乙腈（含琥珀酰丙酮内标及水合肼），65°C孵育30min，过滤至另一96孔板，氮气吹干后每孔加入100µl甲醇，5min后氮气吹干，每孔加入80%乙腈100µl，取20µl进行串联质谱检测。由美国疾病控制中心提供琥珀酰丙酮质控干血滤纸片作为质控样品。参考值上下限为1600例健康儿童的第99和第1百分位。1.2.4 尿有机酸和琥珀酰丙酮检测：尿有机酸和琥珀酰丙酮采用气相质谱法进行检测，具体方法见参考文献[6]。1.2.5 诊断：依据：⑴临床表现：肝肿大，伴或不伴有黄疸；⑵血酪氨酸增高；⑶血或尿琥珀酰丙酮增高。1.2.6 治疗：尼替西农：1mg/Kg.d，分3次口服；不含酪氨酸及苯丙氨酸奶粉：10g/Kg.d。（尼替西农药物由瑞典SWEDISH ORPHAN INTERNATIONAL AB公司免费提供），疗程6个月。2. 结果2.1 患者临床及常规实验室检测结果：患儿均有肝肿大，肝肋下5及4ｃｍ，伴有皮肤黄染。实验室检查显示，胆汁酸、碱性磷酸酶、g－谷氨酰转肽酶及甲胎蛋白显著增高，其值分别为：197及189mmol/L、861及756U/L、229及175U/L、84357及62568ng/ml，胆红素正常，肾功能、血糖及钙、磷、镁水平均正常。一例患儿肝核磁共振显示多发结节，病理活检结果为纤维化结节，非癌变。2.2 血氨基酸、酰基肉碱、琥珀酰丙酮及尿有机酸检测结果 见表1。患者血酪氨酸、酪氨酸与苯丙氨酸比值及琥珀酰丙酮均显著高于参考上限值，苯丙氨酸正常。2.3 尿有机酸检测结果 患儿尿4-羟基苯乙酸、4-羟基苯乳酸及4-羟基苯丙酮酸均显著高于参考上限值，1例患儿尿琥珀酰丙酮增高，另一例正常。2.4 治疗结果 患者经过半年的无酪氨酸奶粉及尼替西龙治疗，肝脏分别由5cm和4cm缩小至3cm和2cm，胆汁酸、碱性磷酸酶、g－谷氨酰转肽酶及甲胎蛋白均显著下降，血和尿琥珀酰丙酮降至正常，血酪氨酸水平轻度下降。尿4-羟基苯乙酸、4-羟基苯乳酸及4-羟基苯丙酮酸均显著下降，但仍明显高于正常，见表1。表1 两例酪氨酸血症-I型患者治疗前后血酪氨酸、苯丙氨酸、琥珀酰丙酮、尿琥珀酰丙酮及有机酸检测结果患者血(mmol/L)尿(检测值与17烷酸的比值）TyrPheTyr/PheSUACSUAC4-羟基苯乙酸4-羟基苯乳酸4-羟基苯丙酮酸参考值20～10020～1200.5～2.01～5.0０8～750～7.00～1.0P1治疗前201.155.53.613.4110.1192.72245.9176.4P1治疗后132.345.22.92.60.0150.7936.55.5P2治疗前347.241.28.49.50.0173.8881.0469.9P2治疗后308.448.06.42.50.0158.0420.8340.0患者P1在停用尼替西农单用特殊奶粉治疗治疗半年后复查，血琥珀酰丙酮升至12.85mmol/L。3 讨论酪氨酸血症I型是一种少见的常染色体隐性遗传病，由于此病缺乏特异性的临床表现，常规实验室检查及其他辅助检查缺乏特异性指标，诊断较困难。多项研究表明琥珀酰丙酮可作为诊断酪氨酸血症-I型的“金指标”[7]。近几年通过串联质质谱检测血琥珀酰丙酮，或通过气相质谱检测尿琥珀酰丙酮，使酪氨酸血症-I型的诊断由困难变为简单。有些国家已将串联质质谱检测血琥珀酰丙酮列为新生儿疾病筛查的常规项目[7,8，9]。但由于气相质谱技术的特点，酪氨酸血症-I型患者尿气相质谱检测琥珀酰丙酮可阴性[10]。本研究2例患儿中尿琥珀酰丙酮1例阳性，1例阴性，而血琥珀酰丙酮均阳性，表明血琥珀酰丙酮检测更有助于酪氨酸血症-I型的诊断。故对于血酪氨酸增高的患者，若尿琥珀酰丙酮检测阴性，需要检测血琥珀酰丙酮。酪氨酸症I型的发病机制主要是由于富马酰乙酰乙酸水解酶活性降低或缺失，导致酪氨酸代谢途径的终端代谢发生障碍，富马酰乙酰乙酸增高，其上游代谢物酪氨酸、4-羟基苯丙酮酸增多，旁路代谢产物4-羟基苯乳酸、4-羟基苯乙酸；中间代谢产物马来酰乙酰乙酸、延胡索酰乙酰乙酸增高，导致其旁路代谢产物琥珀酰乙酰乙酸、琥珀酰丙酮增高。琥珀酰乙酰乙酸、酸琥珀酰丙酮可与蛋白质的巯基结合，是造成肝、肾损害的主要原因[1]。酪氨酸血症I型临床上根据发病年龄可分为急性型(发病年龄<6个月)、亚急性型(发病年龄6个月～2岁)及慢性型(发病年龄>2岁)[3]。急性型多在新生儿期起病，病情进展迅速，早期症状类似于新生儿肝炎，如呕吐、腹泻、嗜睡、生长迟缓、肝脾肿大、水肿、黄疸、贫血、PLT减少和出血症状等，常在3～9月龄死于肝功能衰竭。晚发型通常在1岁以后发病，以生长发育迟缓、进行性肝硬化和肾小管功能受损如低磷性佝偻病、糖尿、蛋白尿以及氨基酸尿等，类似Fanconi综合征表现[11]。此病肝肿瘤发生率较高，约30%患儿在3岁内并发肝肿瘤，主要是小细胞肝癌。约40％患儿在病程中会有急性末梢神经受累危象发生，表现为易激惹，疼痛性感觉异常，躯干与颈部过度伸展，同时伴有自主神经异常症状，如血压增高、心动过速和肠麻痹等。大部分未治疗患儿在l0岁以内死亡。故早期诊断及早期治疗是本病预后好差的关键。酪氨酸血症I型是一种可治性遗传代谢病，主要治疗方法是控制天然蛋白质摄入、给予不含苯丙氨酸、酪氨酸配方营养粉饮食治疗及尼替西农（nitisinone）药物治疗。饮食治疗的目的是减少酪氨酸的摄入及产生，从而降低旁路代谢产物的水平，起到治疗作用。天然蛋白质摄入量需控制在1～1.5g/Kg.d，不含苯丙氨酸、酪氨酸配方营养粉用量为1.5～2.0g/Kg.d。但控制饮食治疗食治疗仅能降低肾并发症的危险，对肝病无效，既不能防止肝病进展，也不能阻止肝癌的发生。有报道饮食治疗1年存活者，若2个月内发病者存活率<40%，2～6个月发病者存活率77%，6个月以后发病者存活率为96%[12]。尼替西农是一种4-羟基苯丙酮酸二氧化酶抑制剂，可抑制酪氨酸转变为4-羟苯丙酮酸，从而使下游代谢产物马来酰乙酰乙酸、延胡索酰乙酰乙酸及其旁路代谢产物琥珀酰丙酮生成减少，起到治疗作用。此药于1992年开始应用于临床，至今多个国家的应用报道显示，对肝脏、肾脏及心脏功能损害改善均有显著的效果[3,11,13,14]。初始剂量为1mg/Kg.d，分2～3次口服。由于此药价格昂贵，也有报道初始计量可从0.55 mg/Kg.d开始，或在治疗过程中将剂量降至0.5mg/Kg.d，也能达到较好的效果[15]，但也有患者需要剂量达到2.0mg/Kg.d才能取得较好的效果[13]。尼替西农治疗后琥珀酰丙酮1个月可降至正常，甲胎蛋白3个月降至正常，部分患者2年后降至正常，也有部分患者甲胎蛋白虽然显著降低，但降不到正常。此类患者肝癌发生率较高，提示甲胎蛋白不降低，或降低速度较慢，预示肝癌发生的可能性大[15]。本室治疗的2例患者尼替西农用量为1mg/Kg.d，治疗1个月后琥珀酰丙酮降至正常，甲胎蛋白及肝功能显著好转。在尼替西农治疗后的预后方面，有报道在治疗的46患者中，1例无效，进行了肝移植；45例有效，其中3例仍进行了肝移植，2例发生肝细胞癌，17例仍有肝异常，6例出现肝硬化；15例甲胎蛋白降不到正常。提示尼替西农仍不能逆转部分患者的病程[3]。至于其不良反应，较多临床应用表明尼替西农比较安全，很少出现不良反应，少见的不良反应为中性粒细胞及血小板减少、皮疹等。但由于尼替西农为4-羟基苯丙酮酸二氧化酶抑制剂，抑制了酪氨酸向4-羟基苯丙酮酸的代谢，故血酪氨酸增高，若血酪氨酸水平超过500mmol/L，需要控制用天然蛋白质摄入，给予不含苯丙氨酸、酪氨酸配方营养粉饮食治疗。否则会由于血酪氨酸水平过高导致角膜损伤。其他治疗方法包括肝移植及基因治疗。肝移植治疗酪氨酸血症Ⅰ型已有20多年历史，可显著改善患者的肝脏、肾脏及神经系统症状。近几年随着尼替西农的应用需要肝移植者逐渐减少。另外，肝移植术后患儿仍有约5%～10%的死亡率，且术后仍需终生进行免疫抑制治疗，且此方法受手术条件及供体数量少的限制，临床上应用存在困难，故当患者肝功能严重衰竭，且对尼替西农治疗无效或由于其他原因得不到尼替西农治疗及肝组织有发生恶变的依据，可选择肝移植治疗。至于基因治疗目前处于动物研究阶段，有报道利用腺病毒作为载体基因治疗酪氨酸血症-I型小鼠模型，可使延胡索酸乙酰乙酸水解酶得到部分修复，治疗12周后肝功能显著好转[16]。

遗传性代谢病包括氨基酸、有机酸、脂肪酸和糖代谢异常及溶酶体贮积病等。既往由于检测方法的限制，使这类遗传性代谢病患儿不能够得到及时确诊，认为是“罕见”的疾病。近年来国际上开展的串联质谱技术(tandem mass spectrometry, MS/MS)，能够检测干血滤纸片中的氨基酸谱和酰基肉碱谱，为临床快速诊断氨基酸、有机酸和脂肪酸代谢性疾病提供了技术支持，结合气相色谱-质谱（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）尿有机酸检测，使诊断更加可靠，推动了遗传性代谢病的筛查、诊断和治疗。上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书串联质谱技术是通过检测样品中物质的质荷比（相对分子质量），对物质进行定性和定量分析，可同时检测一滴血中70余种氨基酸和酰基肉碱，可以对40余种氨基酸、有机酸和脂肪酸氧化代谢病进行快速的筛查和诊断，这些疾病的患病率见表1。目前已有许多国家利用串联质谱进行新生儿筛查及临床疑似患者检测，使相关疾病的患病率显著增加。气相色谱-质谱技术主要通过检测尿液中有机酸，对氨基酸、有机酸和脂肪酸氧化代谢病进行辅助或鉴别诊断。我们国家于2000年开始使用气相色谱-质谱技术进行遗传代谢病检测，2002年开始使用串联质谱进行遗传代谢病新生儿筛查和临床疑似遗传代谢病患者检测，使我国的遗传代谢病的筛查、诊断及治疗技术有了显著提高。上海新华医院利用串联质谱技术筛查269341例新生儿，筛查出14种74例遗传代谢病，阳性率为1/3640，见表2。联合气相质谱技术共检测12100例临床疑似遗传代谢病患儿，确诊遗传代谢病703例，诊断率5.8%，其中以苯丙酮尿症和甲基丙二酸血症常见，见表3。氨基酸代谢病主要是由于氨基酸代谢途径受阻导致体内相应氨基酸水平的增高或降低，其旁路代谢产物有机酸相应增加，对机体造成损伤。串联质谱通过检测血滤纸片中氨基酸水平及相关氨基酸之间的比值对氨基酸代谢病进行检测。气相色谱-质谱则检测患者尿中有机酸辅助诊断。串联质谱对高苯丙氨酸血症、枫糖尿病、瓜氨酸血症、酪氨酸血症、瓜氨酸血症和精氨酸血症的检测具有特异性。由于氨甲酰磷酸合成酶缺乏症和鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症(OTCD)均表现为瓜氨酸降低，故对于串联质谱检测血瓜氨酸降低需者，结合气相色谱-质谱检测尿乳清酸和尿嘧啶水平进行鉴别，升高者为OTCD，正常者为氨甲酰磷酸合成酶缺乏症。酪氨酸血症有3种类型，串联质谱均表现为酪氨酸增高，气相色谱-质谱检测琥珀酸丙酮、4-羟基苯丙酮酸、4-羟基苯乳酸增高者为I型,仅4-羟基苯丙酮酸和4-羟基苯乳酸增高者为II型或III型。有机酸血症是一组遗传代谢病，括MMA、PA、IVA、MCC、HMG、GA-I、GA-II、生物素酶缺乏症和全羧化酶合成酶缺乏症等10余种疾病。由于机体蛋白质、脂肪或糖代谢过程中产生有机酸进一步代谢途径受阻，体内有机酸大量增加，对机体产生危害，体内过多的有机酸一方面与游离肉碱结合，形成不同碳链长度的酰基肉碱，一方面通过尿液排出，患者尿中有机酸水平大量增加。串联质谱通过检测血酰基肉碱水平对有机酸血症进行检测，气相色谱-质谱通过检测尿有机酸水平进行有机酸血症的检测。在有机酸血症中我们国家MMA最常见。脂肪酸氧化代谢病是指脂肪酸进入线粒体途径或脂肪酸在b氧化过程中，由于所需酶的功能障碍导致脂肪酸氧化受阻所导致的一组疾病。由于这些疾病缺乏特异的临床表现和常规实验室检查方法，诊断比较困难。游离肉碱和酰基肉碱是脂肪酸氧化代谢的必需物质及中间产物，故脂肪酸氧化代谢障碍导致体内游离肉碱或酰基肉碱的增高或减少，故可通过串联质谱检测血中游离肉碱或酰基肉碱水平，根据不同长度碳链的酰基肉碱水平的变化可对脂肪酸代谢病进行筛查和诊断。脂肪酸b氧化受阻后，w氧化途径增强，故尿中出现二羧酸尿，但不具特异性。脂肪酸b氧化代谢病在欧美国家的患病率较高,中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症最多见，在高加索人群中的患病率达1:8 100～1:20 000。这些疾病除少数氨基酸疾病外，大部分氨基酸、有机酸和脂肪酸b氧化代谢病缺乏特异的临床症状和体征，新生儿期以喂养困难、呕吐、嗜睡、昏迷和抽搐为主，婴幼儿以运动语言发育落后、智力落后、抽搐、肌张力低下和反复呕吐较常见。体检以小头畸形、肝肿大、心肌肥厚为常见。常规实验室检查以酸中度、高血氨、乳酸增高、低血糖、肌酸激酶增高常见。故当遇到上述临床表现原因不明的患儿，应考虑到遗传性代谢病的可能，留取血样或尿样进行氨基酸、酰基肉碱和有机酸分析特异性检测，以免延误诊治。另外，串联质谱检测采用干血滤纸片，气相质谱可利用新鲜尿液，也可用干尿滤纸片，故样品采集及传递方便，有利于远程递送标本，有助于为外地患者提供服务。表1 氨基酸、有机酸、脂肪酸氧化代谢病患病率病名发生率氨基酸代谢病苯丙酮尿症1/10，000枫糖尿病1/60,000－1、200，000同型胱氨酸尿症1/100,000－1/150,000高甲硫氨酸血症不详酪氨酸血症I型1/100,000-1/120,000酪氨酸血症II型1/250,000－/310,000高脯氨酸血症型不详鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症1/50,000－1/60,000高鸟氨酸血症不详瓜氨酸血症I型1/57,000瓜氨酸血症II型1/40,000－1/60,000精氨琥珀酸尿症1/70,000-1/190.000精氨酸血症1/350,000－1/1,000,000,高鸟氨血症、高氨血症、同型瓜氨酸尿症综合症不详有机酸血症甲基丙二酸血症1/20,000-1/75,000丙酸血症1/30,000-1/750,000异戊酸血症1/80,000－1/100,000戊二酸血症I型1、50，000－1/190,0003-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症1/36,000-1/75,0003-甲基戊烯二酰辅酶A 水解酶缺乏症<1/1000,0003-羟-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症1、100，000生物素酶缺乏症1/60,000全羧化酶合成酶缺乏症1/40,000－80,000b-酮硫解酶缺乏症1/100,000-1/470,000脂肪酸氧化代谢病肉碱转运障碍1/400,000－1/1,000,000肉碱棕榈酰转移酶I缺乏症1/100,000－1/1,000,000肉碱棕榈酰转移酶II缺乏症1/100,000－1/1,000,000肉碱/酰基肉碱移位酶缺乏症1/1000,000短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1/75,000-1/100,000中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1/13,000极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1/79,000短链羟酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1/130,000长链羟酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1/75,000-1/300,000多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1＜1,000,000表2 上海新华医院新生儿串联质谱筛查疾病阳性率筛查数量269341患病率高苯丙氨酸血症299288高甲硫氨酸血症389780枫糖尿病389780瓜氨酸血症-II型2134671酪氨酸血症2134671精氨酸血症1269341同型半胱氨酸血症1269341甲基丙二酸血症8336683-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症929927丙酸血症1269341戊二酸血症－I型1269341短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症389780肉碱转运蛋白缺陷833668中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症389780合计743640表3 临床疑似遗传代谢病患者中氨基酸代谢病疾病种类氨基酸代谢病n占氨基酸代谢病患者比(%)占确诊患者比(%)占检测患者比(‰)高苯丙氨酸血症20356.928.916.8Citrin蛋白缺乏症6417.99.15.3鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症267.33.72.1枫糖尿病236.43.31.9酪氨酸血症II型或III型123.41.71.0瓜氨酸血症-I型102.81.40.8酪氨酸血症-I型51.40.70.4同型半胱氨酸血症41.10.60.3非酮性高甘氨酸血症41.10.60.3高甲硫氨酸血症30.80.40.2精氨酸血症20.60.30.2氨甲酰磷酸合成酶缺乏症10.30.10.1合计357100.050.829.5表4 临床疑似遗传代谢病患者中有机酸血症疾病种类有机酸血症n占有机酸代谢病患者比(%)占确诊患者比(%)占检测患者比(‰)甲基丙二酸血症14555.120.612.0丙酸血症3513.35.02.9多种酰基辅酶A羧化酶缺乏症2911.04.12.4戊二酸血症-I型197.22.71.6异戊酸血症155.72.11.2酮硫解酶缺乏症72.71.00.63-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症41.50.60.33-羟-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症31.10.40.2canavan病20.80.30.2丙二酸血症10.40.10.1甲羟戊酸尿症10.40.10.1延胡索酸尿症10.40.10.1甘油激酶缺乏症10.40.10.1合计263100.037.421.7表5 临床疑似遗传代谢病患者中有机酸血症疾病种类脂肪酸代谢病n占脂肪酸代谢病患者比(%)占确诊患者比(%)占检测患者比(‰)多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症4351.86.13.6中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1214.51.71.0极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1113.31.60.9肉碱转运障碍89.61.10.7短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症56.00.70.4肉碱棕榈酰转移酶I缺乏症－I型22.40.30.2肉碱棕榈酰转移酶I缺乏症－II型22.40.30.2合计83100.011.86.9附：氨基酸、有机酸及脂肪酸代谢病概述（各选2种疾病）苯丙酮尿症苯丙酮尿症（Phenylketonuria，PKU）是是由于体内苯丙氨酸羟化酶活性降低或其辅酶四氢生物喋呤缺乏，导致苯丙氨酸向酪氨酸代谢受阻，体内苯丙氨酸及其代谢产物苯丙酮酸、苯乙酸和苯乳酸显著增加，引起一系列临床表现，是一种常染色体隐性遗传病。本病并不少见，中国患病率约为1:10000,美国约为1：14 000，北爱尔兰约为1/4 400，德国约为1：7 000，日本约为1：78 400。一、临床表现PKU患儿新生儿期无明显特殊的临床症状，3～4个月后逐渐表现出智力、运动发育落后，头发由黑变黄，皮肤白，全身和尿液有特殊鼠臭味，常有湿疹。随着年龄增长，患儿智力低下越来越明显，小头畸形等，严重者可有脑性瘫痪。二、辅助检查（一）血苯丙氨酸及酪氨酸测定血苯丙氨酸³120mmol/L，苯丙氨酸与酪氨酸的比值³2判断为阳性，再做进一步分型诊断。串联质谱可快速检测血苯丙氨酸与酪氨酸浓度，并自动计算其比值，可降低假阳性率或假阴性率。（二）尿液蝶呤谱分析由于四氢生物喋呤缺乏可在尿液中的喋呤谱反映出来，故检测尿液中喋呤谱，有助于PKU分型。（三）血红细胞二氢生物喋啶还原酶活性测定由于部分患儿四氢生物喋呤缺乏是由于二氢生物喋啶还原酶活性缺乏引起，故测定血红细胞二氢生物喋啶还原酶活性有利于二氢生物喋啶还原酶缺乏症的诊断。三、苯丙酮尿症的诊断和分型（一）苯丙酮尿症诊断患者苯丙酮尿症的诊断是依据患儿有智力低下、头发黄、肤色白、运动、语言发育落后的症状，血苯丙氨酸³120mmol/L，苯丙氨酸与酪氨酸的比值³2即可诊断。（二）苯丙酮尿症分型苯丙酮尿症分型首先经尿蝶呤分析和红细胞二氢蝶啶还原酶活性测定分为四氢蝶呤代谢正常和异常2大类。四氢蝶呤代谢正常的PKU有如下4种类型：（1）经典型PKU：苯丙氨酸浓度³1 200mmol/L；（2）轻度高苯丙氨酸血症：血苯丙氨酸浓度在120mmol/L～360mmol/L；（3）中度高苯丙氨酸血症：血苯丙氨酸浓度360mmol/L～1 200mmol/L；(4)四氢生物喋呤反应性苯丙酮尿症：对四氢生物喋呤治疗有效的苯丙酮尿症。四氢蝶呤代谢异常的PKU有3类：(1)6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶缺乏型：尿新喋呤浓度升高，生物喋呤浓度下降。（2）二氢蝶啶还原酶缺乏型：血红细胞二氢蝶啶还原酶活性下降。（3）鸟苷三磷酸环化水解酶I缺乏型：尿新喋呤浓度及生物喋呤浓度均下降。四、治疗苯丙酮尿症的治疗需要根据分型采取针对的治疗措施。（一）经典性PKU、中度高苯丙氨酸血症和轻度高苯丙氨酸血症的治疗：给予不含苯丙氨酸的配方奶粉或蛋白粉及天然奶粉混合喂养。使血苯丙氨酸控制在允许范围：0～3岁 120～240 mmol/L ；3～8岁180～360 mmol/L；8～13岁180～480 mmol/L；13～18岁180～600 mmol/L；>18岁180～900 mmol/L。定期复查血苯丙氨酸浓度，根据苯丙氨酸浓度是否在合适的范围，调整每日食入不含苯丙氨酸的配方奶粉或蛋白粉的量。（二）四氢生物喋呤反应性苯丙酮尿症：可按上述给予不含苯丙氨酸的特殊奶粉或蛋白粉治疗，也可用四氢生物喋呤治疗，只是用四氢生物喋呤费用较高，不同患者家庭可根据经济情况选择治疗方法，但血苯丙氨酸的控制水平要求同上。（三）6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶缺乏型及二氢蝶啶还原酶缺乏型的治疗。由于这2种类型不是由于苯丙氨酸羟化酶活性缺乏引起，而是由于四氢生物蝶呤缺乏引起，故需服用四氢生物蝶呤治疗，不需要给予特殊奶粉治疗。但由于四氢生物蝶呤缺乏同时可引起神经递质的缺乏，故需要同时给予5-羟色胺及左旋多巴治疗。五、苯丙酮尿症预防苯丙酮尿症是可以预防的，包括产后预防苯丙酮尿症患儿的发病及产前预防苯丙酮尿症患儿的出生。（一）预防苯丙酮尿症的发病预防苯丙酮尿症的发病必须早期诊断、早期治疗，在出生后1～2个月内诊断和有效治疗可避免神经系统受到损伤。这种在婴儿出生后1个月之内，还未发病之前检测疾病的方法称为新生儿疾病筛查，是早期诊断的有效方法，既在新生儿出生3天后采血，检测血苯丙氨酸及酪氨酸浓度，以便确诊或排除苯丙酮尿症，达到预防发病的目的。（二）苯丙酮尿症产前诊断苯丙酮尿症患者母亲可在再次怀孕16～20周时抽取羊水，检测胎儿是否带有苯丙酮尿症致病基因突变，进行产前诊断。综上所述苯丙酮尿症是一种可以治疗的遗传代谢病，早期治疗效果较好。并且可以通过新生儿疾病筛查，做到发病前诊断，及时治疗，预防发病。对于已经有PKU患儿的家庭，若患儿父母再想要孩子，可以通过产前诊断判断胎儿是否患有苯丙酮尿症。枫糖尿病一、概况枫糖尿病(Maple Syrup Urine Disease, MSUD)是由于支链a酮酸脱氢酶复合体活性缺陷导致亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸代谢代谢受阻，体内亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸及其代谢产物a酮酸增多，引起的代谢紊乱，属于常染色体隐性遗传病。国外报道MSUD患病率约为1:185,000，我国在26万例新生儿中筛查出3例（1:86,667）,说明并不少见。二、临床表现及分型1. 经典型MSUD：早期表现为呕吐或喂养困难，嗜睡，哭声高尖，肌肉松弛，或肌张力增高，全身肌肉僵直，角弓反张，呼吸暂停、昏迷，甚至死亡。未进行有效治疗的患儿很少存活，存活者遗留下永久性神经损伤以及严重的智力障碍。全身有焦糖样气味。2. 间歇型MSUD：平时表现正常，在应激状态中(如感染或外科手术)逐渐出现呕吐、共济失调、嗜睡及昏迷，甚至死亡。3. 轻型MSUD：新生儿期后逐渐出现轻微病症。临床表现呈隐袭性，且局限于中枢神经系统，患儿有轻-中度精神发育迟缓，伴或不伴癫痫发作。4. 维生素B1反应型MSUD：对维生素B1有效，每天需要200～400mg维生素B1。三、辅助检查1. 血串联质谱质谱氨基酸检测：亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸显著增高。2．尿气相色谱质谱有机酸检测：2-酮异己酸、2-酮-3-甲基异戊酸、2-酮异戊酸、2-羟基-异己酸、2-羟基-3-甲基异戊酸及2-羟基-异戊酸显著增高。四、诊断根据神经系统异常表现，血亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸显著增高，尿a－酮酸显著增高即可诊断。三、治疗（一）急性期治疗1. 停止喂养或给予枫糖尿病奶粉（不含亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸）喂养，静滴10%葡萄，维持电解质平衡。2. 血液透析或腹膜透析降低支链氨基酸及a酮酸水平。3. 维生素B1：300mg/d，连续3周。4. 补充异亮氨酸和缬氨酸：100～250mg/Kg.d（二）稳定期治疗1．对维生素B1无效型枫糖尿病：给予不含亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸的特殊奶粉喂养，可补充异亮氨酸和缬氨酸：100～250mg/Kg.d，要求血氨基酸控制目标为：亮氨酸150～300mmol/L，异亮氨酸150～300mmol/L，缬氨酸200～400mmol/L。（2） 补充异亮氨酸和缬氨酸：100～250mg/Kg.d（3）肝移植2．对维生素B1有效型枫糖尿病：（1）维生素B1：200～1000mg/d.（2）特殊奶粉：不含亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸甲基丙二酸血症甲基丙二酸血症（methylmalonic acidemia, MMA）主要是由于甲基丙二酰辅酶A变位酶（methylmalonyl-CoA mutase, MCM）或其辅酶钴胺素(cobalamin,cbl,Vitmin B12)缺陷，导致体内甲基丙二酸、丙酸、甲基枸橼酸等代谢物异常蓄积，引起神经、肝脏、肾脏、骨髓等多脏器损伤，是一种常见的有机酸血症，属于常染色体隐性遗传病，患病率美国为1：48,000；意大利患病率为1：115,000；德国为1：169,000；日本为1：50,000。一、甲基丙二酸血症病因及分型甲基丙二酸血症根据酶缺陷的类型分为MCM缺陷及其辅酶钴胺素( VitB12)代谢障碍两大类。MCM又分为无活性者为mut0型，有残余活性者为mut-型。辅酶钴胺素代谢障碍包括：腺苷钴胺素合成缺陷，即线粒体钴胺素还原酶缺乏（cblA）和钴胺素腺苷转移酶缺乏（cblB）；以及3种由于胞浆和溶酶体钴胺素代谢异常引起的腺苷钴胺素（adenosylcobalamin, AdoCbl）和甲基钴胺素(methylcobalamine,MeCbl)合成缺陷（cblC、cblD和cblF），这3种类型患者除有甲基丙二酸血症外，还伴有同型半胱氨酸血症。二、甲基丙二酸血症的临床表现MMA临床表现各异，往往易于误诊，最常见的症状和体征是嗜睡、生长障碍、反复呕吐、脱水、呼吸困难、酸中毒、肌张力低下或增高、抽搐、智力、运动、语言发育落后及小头畸形。三、辅助检查：（一）常规实验室检查：代谢性酸中毒、乳酸增加、电解质紊乱，白细胞、血红蛋白及血小板减少，血氨升高、尿酮体及尿酸升高，肝肾功能异常等。（二）特殊检测 血串联质谱检测丙酰肉碱（propinoylcarnitine,C3）、C3/C0（游离肉碱）和C3/C2（乙酰肉碱）显著升高[。尿液中甲基丙二酸、甲基枸橼酸和3-羟基丙酸显著增加。这是确诊MMA的特征指标。（三）血同型半胱氨酸测定： cblC、cblD和cblF）型MMA患者血同型半胱氨酸血症增高。（四）影像学检查 MMA患者脑CT、MRI 扫描常见对称性基底节损害。MRI 显示双侧苍白球信号异常，表现为脑白质脱髓鞘变性、软化、坏死、脑萎缩、脑积水等。四、诊断根据临床表现、血串联质谱检测C3C及3/C2增高，尿甲基丙二酸增高即可诊断。根据血同型半胱氨酸水平，诊断是否伴同型半胱氨酸血症。维生素B12负荷试验：确诊MMA患者，需要进行VitB12负荷试验，以便确定是否VitB12是否有效，即连续三天肌内注射VitB12， 1mg/d，若症状好转，生化异常改善，则为VitB12有效型。五、甲基丙二酸血症的治疗（一）MMA急性期治疗甲基丙二酸血症急性期治疗应以补液、纠酸为主，同时应限制蛋白质摄入，供给适当的热量。如果出现低血糖，可先行静脉注射葡萄糖1~2g/kg，随后补充10%的葡萄糖溶液[1]。若持续高氨血症（血氨>600μmol/L），则需要通过腹透或血液透析去除毒性代谢物。为稳定病情可用左旋肉碱，100～300mg/kg/d，静滴或口服；VitB12，1mg/d，肌注，连续3～6天。（二）MMA长期治疗1. 饮食治疗 原则是低蛋白、高能饮食，减少毒性代谢产物蓄积。使用不含异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸和蛋氨酸的特殊配方奶粉或蛋白粉[15]。由于这些氨基酸为必需氨基酸，故特殊配方奶粉不能作为蛋白质的唯一来源，应进食少量正常蛋白质。维生素B12无效型以饮食治疗为主，天然蛋白质摄入量控制在0.8~1.2g/kg/d，蛋白质总摄入量婴幼儿期应保证在2.5～3.0g/kg/d，儿童每天30～40g，成人每天50～65g，不足部分由特殊奶粉或蛋白粉补充。对于维生素B12有效型，蛋白饮食限制不需过于严格。2．药物治疗 ①维生素B12：用于维生素B12有效型的长期维持治疗，每周肌内注射1mg，1~2次，部分患儿可口服甲基钴胺素500～1000μg/d。也有研究提出肌注钴胺素较口服更能有效地降低同型半胱氨酸以及甲基丙二酸的水平[16]。羟钴胺治疗后，约90%的cb1A患者症状好转，40%的cb1B患者体内甲基丙二酸水平降低。②左旋肉碱：促进甲基丙二酸和酯酰肉碱排泄，增加机体对自然蛋白的耐受性，常用剂量为50～100mg/kg/d，急性期可增至300mg/kg/d，口服或静脉滴注。③甜菜碱：用于合并同型半胱氨酸尿症患者，500～1000mg/d，口服。④叶酸：用于合并贫血或同型半胱氨酸尿症患者，10～30mg/d，口服。⑤维生素B6：12～30mg/d，口服。⑥甲硝唑（10~20mg/kg, tid）或新霉素（50mg/kg, tid），可减少肠道细菌产生的丙酸，但长期应用可引起肠道菌群紊乱，应慎用。⑦氨基甲酰谷氨酸（50～100mg/kg/d）以及苯甲酸钠（150～250mg/d）治疗，可改善高氨血症以及高甘氨酸血症。⑧应急时使用胰岛素或生长激素，可增加蛋白及脂质合成并改善体内代谢。3．肝、肾移植治疗 对于维生素B12无效型且饮食控制治疗效果较差的患者可尝试肝脏移植治疗。研究表明肝移植仅能部分纠正MMA代谢缺陷，不能预防肾脏以及神经退行性病变的进展[17]。肾移植可纠正肾衰并在一定程度上减少甲基丙二酸浓度。也有研究认为肝-肾联合移植可能比单独肝移植要好，但其长期预后及移植存活率仍不确定。五、甲基丙二酸血症预防甲基丙二酸血症是可以预防的，包括产后预防甲基丙二酸血症患儿的发病及产前预防甲基丙二酸血症患儿的出生。（一）预防甲基丙二酸血症的发病预防甲基丙二酸血症的发病必须早期诊断、早期治疗，在出生后1～7天内诊断和有效治疗可避免或减轻神经系统受损伤。新生儿疾病筛查，是早期诊断的有效方法，既在新生儿出生1～7天内采血，检测血C3及C3/C2，以便确诊或排除甲基丙二酸血症。（二）甲基丙二酸血症产前诊断甲基丙二酸血症患者母亲可在再次怀孕16～20周时抽取羊水，羊水进行串联质谱及气相质谱检测，观察C3、C3/C2及甲基丙二酸是否增高。同时对羊水中胎儿细胞进行甲基丙二酸血症致病基因突变检测，进行产前诊断。丙酸血症丙酸血症血症（propionic acidemia, PA），是由于丙酰CoA酶羧化酶活性缺乏，导致体内丙酸血症及甲基枸橼酸等代谢产物异常蓄积，引起神经系统和其他脏器损害症状，属于常染色体隐性遗传病。PA临床表现个体差异较大，多数患儿在出生后1个月内起病，典型急性期临床表现为喂养困难、反复呕吐和嗜睡等。该病患病率有种族和地区差异，美国活产婴儿为1:100 000，沙特阿拉伯国家为1:2000～1:5000，格陵兰因纽特人高达1:1000，我国没有相关的报道。临床表现二、丙酸血症血症的临床表现丙酸血症血症临床表现各异，往往易于误诊，最常见的症状和体征是嗜睡、生长障碍、反复呕吐、脱水、呼吸困难、酸中毒、肌张力低下或增高、抽搐、智力、运动、语言发育落后及小头畸形。三、辅助检查：（一）常规实验室检查：代谢性酸中毒、乳酸增加、白细胞、血红蛋白及血小板减少，血氨升高、尿酮体阳性，肝肾功能异常等。（二）特殊检测 血串联质谱检测丙酰肉碱（propinoylcarnitine,C3）、C3/C2（乙酰肉碱）及甘氨酸显著升高。尿液中3－羟基丙酸及甲基枸橼酸显著增加。这是确诊丙酸血症血症的特征指标。（三）影像学检查 丙酸血症血症患者脑CT、MRI 扫描常见对称性基底节损害。MRI 显示双侧苍白球信号异常，表现为脑白质脱髓鞘变性、软化、坏死、脑萎缩、脑积水等。四、诊断根据临床表现、血串联质谱检测C3、C3/C2及甘氨酸增高，尿3－羟基丙酸及甲基枸橼酸增高即可诊断。三、治疗PA缺乏特异的治疗方法，丙酸血症血症急性期主要为对症治疗，以终止蛋白摄入、静脉输入葡萄糖和纠正酸中毒为主，必要时进行腹膜透析和血液透析。长期治疗以控制蛋白质饮食为主，给予不含异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸和苏氨酸的配方奶，补充左旋肉碱利于丙酰辅酶A的代谢和排除。1. 饮食限制长期治疗以限制蛋白饮食为主，但要保证足够的蛋白质和能量。每日所需总蛋白质量，婴儿为2.5～3.5g/kg，儿童为30～40g，成人为50～65g，不足部分用不含缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸的配方奶，或蛋白质替代。同时避免饥饿，抑制肌肉组织和脂肪组织代谢。2. 口服药物（1）左旋肉碱：有利于与体内的酸性物质结合，促进酸性物质的代谢和排出，急性期：100～200mg/Kg×d，静滴；稳定期：50～100mg/Kg×d，口服。（2）新霉素或甲硝唑：由于体内丙酸血症一部分是由肠道细菌的代谢产生吸收如血液，新霉素和甲硝唑可抑制肠道细菌的繁殖代谢，减少肠道细菌代谢产生的丙酸血症。用法：新霉素为50mg/kg×d，甲硝唑为10~20mg/kg×d。由于长期使用抗生素会导致肠道内菌群紊乱，所以不建议长期使用，可在急性期使用。3. 肝移植近几年肝移植作为一种治疗PA的方法已取得明显的进步。Barshes等对12名接受活体肝移植的PA患儿研究显示，一年内存活率为72.2%，一些病人临床症状明显改善，无需进行饮食限制和其他医学治疗。五、丙酸血症血症预防丙酸血症血症是可以预防的，包括产后预防丙酸血症血症患儿的发病及产前预防丙酸血症血症患儿的出生。（一）预防丙酸血症血症的发病预防丙酸血症血症的发病必须早期诊断、早期治疗，在出生后1～7天内诊断和有效治疗可避免或减轻神经系统受损伤。新生儿疾病筛查，是早期诊断的有效方法，既在新生儿出生1～7天内采血，检测血C3及C3/C2，以便确诊或排除丙酸血症血症。（二）丙酸血症血症产前诊断丙酸血症血症患者母亲可在再次怀孕16～20周时抽取羊水，羊水进行串联质谱及气相质谱检测，观察C3、C3/C2及3－羟基丙酸是否增高。同时对羊水中胎儿细胞进行丙酸血症致病基因突变检测，进行产前诊断。综上所述，虽然PA患儿临床表现严重，但随着诊断技术的提高，患者诊断的年龄越来越早，为及时的有效治疗提供了机会，患者的预后得到明显改善。且随着对PA的发病机制及诊断治疗的研究深入，必将为PA患儿提供更有效的治疗方法。 肉碱转运障碍肉碱转运障碍(Carnitine transporter deficiency,CTD)是由于细胞膜上肉碱转运蛋白缺陷，导致肉碱摄入减少，引起体内脂肪酸氧化代谢障碍引起的遗传代谢病，属于常染色体隐性遗传病。临床表现 肉碱转运障碍典型的常见症状为低酮型低血糖、酸中毒，严重者可至突然死亡。其他临床表现，类似Reye综合症，表现为高血氨、转氨酶水平升高、肌酸激酶升高。部分患者表现为心肌病、肝肿大及肌无力，肌肉活检可见脂质沉积。肉碱转运障碍患者禁食12小时后可出现低酮型低血糖。由于肉碱在动物蛋白中含量较高，若仅吃素食可诱发此病发作。二、辅助检查（一）常规检查：低血糖、酸中毒、高血氨、转氨酶水平升高、肌酸激酶升高、乳酸显著升高。部分患者B超可发现心肌肥大、肝肿大或多囊肾。（二）特殊检查：1.血串联质谱检查：游离肉碱显著降低,从短链至长链酰基肉碱均有不同程度的降低。2.尿气相色谱质谱检查：乳酸、戊二酸、乙基丙二酸、己二酸、辛二酸、癸二酸、2-羟基丁酸、2-羟基戊二酸、5-羟基己酸、3-羟基异戊酸和2-羟基异己酸增高，或无显著异常。三、诊断依据临床表现、血串联质谱游离肉碱及酰基肉碱显著降低，排除其他因素引起的肉碱降低可以诊断。四、治疗采用左旋肉碱治疗该病已取得成功，使血浆和肝脏中游离肉碱浓度升高，阻滞低酮型低血糖的发作，心肌病及肝肿大可在数月内恢复正常。左旋肉碱剂量每天100～300mg/kg。治疗期间每1～3个月复查血串联质谱，观察游离肉碱及其他酰基肉碱水平，以便调整剂量。多种酰基CoA脱氢酶缺乏症多种酰基辅酶A 脱氢酶缺乏症( multiple acyl-CoA dehydrogenase deficiency , MADD)又称为戊二酸尿症- II型(glutaric aciduria type-II)，是一种脂肪酸b氧化代谢障碍的常染色体隐性遗传病，主要由于电子转运黄素蛋白（Electron transfer flavoprotein, ETF）或电子转运黄素蛋白辅酶Q氧化还原酶（Electron transfer flavoprotein: Ubiquinone oxidoreductase ETF-QO）缺陷，继发多种酰基辅酶A 脱氢酶缺陷（短链、中链、长链和极长链酰基辅酶A脱氢酶），导致脂肪酸b氧化代谢障碍，引起多种酰基肉碱（短链、中链、长链和极长链酰基肉碱）等中间代谢产物蓄积，引起一系列临床表现。二、临床表现典型多种酰基CoA脱氢酶缺乏症的婴儿，在新生儿期即有严重表现，出生几个小时内呼吸急促、酸中毒和低血糖，静滴葡萄糖和碳酸氢钠难以纠正，并很快出现心脏骤停，甚至死亡。部分患儿发病晚，表现为反复呕吐、低酮性低血糖、酸中毒、转氨酶升高。部分患儿有畸形表现，包括括前额凸出，鼻梁凹陷和鼻短，耳朵低位，巨头，多囊肾，肾脏巨大等。成年患者多表现为肌无力、脂质沉积性肌病和肉碱降低。急性发作时出现低酮性低血糖、酸中毒、高血氨、转氨酶水平升高、乳酸显著升高。二、辅助检查（一）常规检查：低血糖、酸中毒、高血氨、转氨酶水平升高、肌酸激酶升高、乳酸显著升高。部分患者B超可发现心肌肥大、肝肿大或多囊肾。（二）特殊检查：1.血串联质谱检查：多种酰基肉碱增高,从短链至长链酰基肉碱均有不同程度的增高，部分患者游离肉碱下降。2.尿气相色谱质谱检查：乳酸、戊二酸、乙基丙二酸、己二酸、辛二酸、癸二酸、2-羟基丁酸、2-羟基戊二酸、5-羟基己酸、3-羟基异戊酸和2-羟基异己酸增高。（三）成人患者：肌肉活检显示脂质沉积。三、诊断依据临床表现、血串联质谱多种酰基肉碱显著增高及尿气相质谱检测二羧酸显著增高可进行诊断。四、治疗1.新生儿期发作型患者的治疗方法是支持性的，尤其是补充大量适当的液体，治疗酸中毒，低血糖和脱水。2.左旋肉碱：100～200mg/Kg.d,静滴，或分3次口服。3.维生素B2：对维生素B1有效患者，可给予维生素B1治疗，100～300mg/d.

上海交通大学医学院附属新华医院，上海市儿科医学研究所韩连书近几十年随着社会经济的发展，人们生活水平的提高，青春期发育开始的年龄越来越提前。医学上将女孩在8岁前，男孩在9岁前出现青春期（第二性征）发育称为性早熟。上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书一、 性早熟的症状性早熟的症状女孩表现为乳房增大伴硬结、乳晕增大、色素沉着，阴毛、腋毛出现。男孩表现为阴茎和睾丸增大，腋毛、阴毛、喉结出现，声音变粗。另外，一部分儿童仅仅有乳房或阴毛的早发育，而无其他性征的异常称为单纯性乳房早发育或单纯性阴毛早发育，又称为青春发育变异。二、 性早熟的原因性早熟的原因很多，也很复杂，主要包括两个方面的因素，一方面是饮食和生活环境等外部因素，另一方面是自身的内部因素。饮食和生活环境对性发育的影响，首先是由于近10多年来经济的迅速发展，人们的物质生活水平有了很大提高，蛋白质摄入增加，甚至出现营养过剩，肥胖儿童。而营养过剩有助于性发育，有研究证实中度肥胖儿童易出现性早熟。其次，在一些食品、保健品和水果中，可能含有性激素或类似激素的物质，即环境激素，儿童经常使用这些含有激素的食品就容易出现性早熟。再次，物质生活水平提高的同时，精神文化生活也相当丰富，现实的环境使儿童有较多的机会目睹有关情爱的场面、画面和书籍，这对性发育也有促进作用。还有少部分儿童由于误服避孕药引起性早熟。这是因为家长未能将避孕药保管好，年幼儿童误将避孕药当糖吃，避孕药的成分就是性激素，导致性早熟。儿童自身的原因是由疾病引起的，这些疾病主要分布在三个部位：颅内、肾上腺和性腺（睾丸和卵巢）。颅内引起性早熟的疾病有肿瘤、脑脓肿、脑炎、脑积水、脑外伤、颅内手术、颅内放疗和化疗等。肾上腺引起性早熟的疾病有肾上腺肿瘤、先天性肾上腺皮质增生症等。睾丸引起性早熟的疾病有睾丸间质细胞瘤和家族性睾丸中毒病。卵巢引起性早熟的疾病有卵巢肿瘤和卵巢囊肿。另外，还有一些疾病如肝脏肿瘤、甲状腺功能低下等也可引起性早熟，只是较少见。一些药物如部分抗肿瘤药、异烟肼、酮康唑和性激素等也可引起性早熟。三、性早熟的预防虽然性早熟的原因很多，且很复杂，对于一部分性早熟还是可以预防的。首先针对饮食因素，应多样化，避免进食单一食物，尽量不用保健品或补品，保持营养均衡，避免肥胖。肥胖儿童应控制饮食，多运动，减轻体重。对于环境因素，目前在提倡及早进行性教育，让儿童和青少年了解性发育的同时，儿童应尽量少看对情爱描写较多的电视节目或书籍。家长应将避孕药保管好，放在儿童拿不到的地方。而对于继发于疾病或药物的性早熟预防，主要是在患这些疾病时或用上述有关药物时注意有无性征的提前发育，以便及早发现及早治疗。由于性早熟往往是某些疾病的首发症状，当发现性早熟时应及时到医院专科门诊检查，明确病因，及时治疗，以免耽误病情。四、性早熟的治疗若发现孩子有性早熟表现，首先要带孩子到小儿内分泌、遗传代谢病门诊就诊，由医生检查后明确诊断，再进行针对性治疗，不可盲目治疗。一般假性性早熟（如单纯乳房发育）可服用中药治疗，若为真性性早熟，需要西药治疗，或中西药结合治疗。

酪氨酸血症Ⅰ型（Tyrosinemia typeⅠ,OMIM 276700）是一种常染色体隐性遗传病，是由于酪氨酸代谢过程的终末酶延胡索酰乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydroxylase；FAH）缺陷，导致体内酪氨酸及其代谢产物琥珀酰丙酮、4-羟基苯乳酸及4-羟基苯丙酮酸等蓄积，对机体造成损害。该病主要累积肝脏及肾脏，严重者可危及生命。总患病率约为1:100 000-1:120 000,在加拿大魁北克省的某些地区可高达1:2 000[1]，我国此病的患病率尚不清楚。近几年随着串联质谱及气相色谱质谱在遗传代谢病检测中的应用，越来越多的患者得到诊断[2]，现就酪氨酸血症Ⅰ型的诊治进展进行分析。上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书1 病因及发病机制酪氨酸血症Ⅰ型是因编码FAH的基因发生突变以致FAH活性降低或缺失，酪氨酸分解代谢发生障碍，中间代谢产物如马来酰乙酰乙酸、延胡索酰乙酰乙酸、琥珀酰乙酰乙酸及琥珀酰丙酮等在体内蓄积，造成机体损伤。动物模型实验证明延胡索酰乙酰乙酸主要在细胞内蓄积，对细胞内的许多生化过程产生不良影响，如促进线粒体中细胞色素C释放，增加氧化应激，加速细胞凋亡；加速细胞内谷胱甘肽的消耗，使细胞抗氧化能力下降，造成细胞损伤；而琥珀酰丙酮和琥珀酰乙酰乙酸被释放到细胞外，造成其它多个脏器损伤，主要是肾小管功能损害；琥珀酰丙酮可抑制红细胞卟胆原合成酶的活性，致使血红素合成障碍，血及尿中δ-氨基乙酰丙酸（δ-ALA）增多，患者发生类卟啉症性神经危象[1；3]。由于FAH主要在肝脏及肾小管细胞中表达，因此该病主要累积肝脏及肾脏。所有酪氨酸血症Ⅰ型患者最终发生肝细胞癌的风险都较高，具体发病机制目前尚未明确。Orejuela等[4]研究发现，酪氨酸血症Ⅰ型患者肝脏病变介导的肝应激长期增加，激活了AKT存活途径，抑制细胞固有的凋亡机制，造成细胞存活与死亡机制异常，可能与其肝细胞癌的发生有关。亦有学者研究认为，患者肝细胞中积聚的毒性中间代谢产物如琥珀酰丙酮等对细胞内蛋白诱导的DNA修复过程造成不良影响，致使肝细胞基因表达异常，导致肝细胞癌的发生[5]。2 临床表现酪氨酸血症I型可于任何年龄发病，但多数患者于新生儿及婴儿时期发病，临床表现多种多样，甚至同一家系中的不同患者亦可有不同表现[1]。临床上根据患者的发病年龄分为急性型和慢性型。急性型多于生后6个月内发病，出生后即可出现呕吐、腹泻，体重不增，肝大、黄疸和腹水，出血、低血糖及水肿也较常见。如不及时治疗，病情可迅速进展为肝衰竭、严重的凝血功能异常，患者多于生后6～8个月内因肝衰竭死亡；幸存者进入慢性期，最终发展为慢性肝功能不全、肝硬化或肝细胞癌[3]。慢性型病情相对稳定，临床表现也较轻，症状多于出生6个月以后出现，主要表现为慢性肝、肾功能损害，结节性肝硬化及肾小管性肾功能障碍常见，可伴有低磷性佝偻病及类卟啉症性神经危象表现。少数患者有低血糖表现。亦有并发心肌病及以肝细胞癌为首发症状的报道[6,7]。3 实验室检查3.1 一般实验室检查 多数患者肝功能检查异常。血浆转氨酶及胆红素水平升高；多伴有低蛋白血症。凝血因子合成减少，凝血功能异常明显。肾小管功能受损，出现蛋白尿、氨基酸尿和高磷尿，而血磷降低。因血红素合成受抑制，可有贫血。血浆甲胎蛋白水平显著升高[8]。3.2 血串联质谱和尿气相色谱质谱检测 利用串联质谱技术对患者血氨基酸及琥珀酰丙酮水平进行检测，发现血酪氨酸及琥珀酰丙酮增高，部分患者伴有血苯丙氨酸增高[9]。利用气相色谱质谱检测患者尿有机酸水平，可发现尿液中排出的4-羟基苯乳酸、4-羟基苯乙酸、4-羟基苯丙酮酸及琥珀酰丙酮水平增高。另外，由于患者体内积聚的琥珀酰丙酮可抑制红细胞卟胆原合成酶活性，尿中排出δ-ALA水平升高[8]。3.3 酶学分析 酪氨酸血症Ⅰ型患者FAH活性低下或缺失。可通过测定肝活检组织、成纤维细胞或外周血淋巴细胞中FAH活性诊断此病。3.4 基因检测 酪氨酸血症Ⅰ型的致病基因FAH定位于人染色体15q23-25，目前已检测到40余种基因突变，其中最常见的是IVS12+5(G>A)，在加拿大魁北克省某些地区的患者中可占90%；在欧洲南部、摩洛哥及土耳其等地区患者中发现另一种常见突变IVS6-1(G>T)，约占60%；另外还有一些类型的突变分别在某些种族患者中较常见,如W262X在芬兰人中常见，D233V在土耳其人中常见，P261L在德系犹太人中常见；Q64H在巴基斯坦患者中常见[10]。这些突变多为单个碱基的突变，如错义突变、无义突变或剪辑点突变，FAH基因小片段缺失和插入亦有相关报道；Park等[11] 曾报道1例患者的FAH基因存在大片段缺失。4 酪氨酸血症Ⅰ型的诊断及鉴别诊断酪氨酸血症Ⅰ型诊断依据：（1）临床表现：患者多有肝脏及肾脏功能损害的临床表现，如黄疸、腹水、生长发育迟滞以及佝偻病的症状及体征，此外还可发生神经危象；（2）实验室检查肝功能损害表现，如转氨酶及胆红素升高、凝血功能异常等；（3）肾功能损害，如氨基酸尿、磷酸盐尿、血磷低及肾小管性酸中毒等；（4）血浆甲胎蛋白水平显著升高；（5）血酪氨酸及琥珀酰丙酮升高；（6）尿4-羟基苯乳酸、4-羟基苯乙酸、4羟基苯丙酮酸及琥珀酰丙酮水平增高。血或尿琥珀酰丙酮增高是诊断酪氨酸血症Ⅰ型的必要条件[12]。有条件者可行血白细胞酶活性测定或基因突变检测进行确诊。酪氨酸血症Ⅰ型需要与如下疾病进行鉴别诊断：（1）其它引起血酪氨酸水平升高的疾病，如酪氨酸血症Ⅱ型及Ⅲ型，高蛋白质饮食引起的暂时性血酪氨酸水平增高，新生儿暂时性高酪氨酸血症等；（2）其它具有肝功能障碍表现的疾病，如半乳糖血症，遗传性果糖不耐症，线粒体细胞病，先天性糖基化障碍性疾病，以及细菌及病毒感染导致的肝脏损害等；（3）其它具有肾损害表现的疾病，如Lowe综合征、胱氨酸病、Fanconi综合征等；（4）有佝偻病表现的患者还需同低磷酸酯酶症、维生素D缺乏性佝偻病、维生素依赖性佝偻病、低磷酸盐血症引起的佝偻病等进行鉴别。5. 酪氨酸血症Ⅰ型的治疗酪氨酸血症Ⅰ型的治疗目的是降低血酪氨酸及其代谢产物水平，减轻酪氨酸及其代谢产物对机体的损伤。5.1 尼替西农治疗5.1.1 作用机制及用量 尼替西农是4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的抑制剂，该酶催化酪氨酸降解过程中4-羟基苯丙酮酸转化为尿黑酸。尼替西农通过抑制4-羟基苯丙酮酸双加氧酶活性，减少下游一系列毒性代谢产物如延胡索酰乙酰乙酸，马来酰乙酰乙酸和琥珀酰丙酮的生成，同时酪氨酸、4-羟基苯丙酮酸及苯乳酸水平相应升高。尼替西农的推荐起始用量为每天1mg/kg [3]。近年来El-Karaksy等[13]通过对4名酪氨酸血症Ⅰ型患者给予低于推荐剂量的尼替西农治疗，并进行12～27个月不等的随访，证明在患者血琥珀酰丙酮及甲胎蛋白水平能够维持在正常范围的情况下，采用小剂量用药方法，亦可使病情得到有效控制。5.1.2 治疗效果 尼替西农起效快，多数患者经治疗后血琥珀酰丙酮显著降低；有急性肝衰竭表现者，90%在接受治疗数天后临床症状即可迅速缓解，凝血功能明显改善，而血清转氨酶等其它肝功能的生化指标可能需要较长时间才能恢复正常水平[3;14]。Arnon等[15]研究发现自从尼替西农应用后，进行肝移植手术治疗的患者数量显著减少，进一步证实尼替西农能够显著改善患者的肝功能。另有研究发现在出生6个月内即开始尼替西农治疗的患者，肝细胞癌的发生率明显降低；2岁以后开始治疗者，肝细胞癌发生率与未用尼替西农治疗者相当[16,17]。Masurel等[18]对46名接受尼替西农治疗的患者进行回顾性研究，这些患者平均治疗时间长达4年9个月，其中2名患者在随访过程中发生肝细胞癌，6名患者表现有持续性的肝硬化。这些结果提示尼替西农并不能消除肝细胞癌发生的可能，只有早期即予应用才可能降低肝细胞癌的发生率。Santra 等[19]通过对21名患者的治疗效果分析，尼替西农对改善肾小管功能亦有显著作用。本研究室利用尼替西农治疗2例患者，临床症状均显著好转，血尿琥珀酰丙酮降至正常，显示较好效果[20]。5.1.3 尼替西农治疗的不良作用及治疗监测 尼替西农治疗耐受性良好，副作用很少。但可引起血酪氨酸水平增高，若其长期高于500mmol/L,可产生类似酪氨酸血症Ⅱ型表现，如眼部病损，如畏光及角膜炎[14]。少数患者可出现非特异性皮疹；极少数治疗后可出现血小板及中性粒细胞暂时性减少[18]。最近有报道尼替西农对患者的神经心理学发育产生影响，可能与其血及脑脊液中高浓度的酪氨酸水平有关[18；21]。接受尼替西农治疗的患者除了密切监测血酪氨酸及琥珀酰丙酮水平外，还需定期检测肝肾功能、凝血功能、血浆甲胎蛋白及尼替西农血药浓度，并依据各种检测结果调整用药量。由于尼替西农治疗并不能完全消除肝细胞癌的发生，应定期行肝脏超声、CT或MRI等影像学检查。5.2 饮食疗法 目前已不推荐单纯的饮食治疗，但由于尼替西农可能引起血浆酪氨酸水平增高，造成患者眼部及皮肤病损，甚至影响大脑发育，因此患者在接受尼替西农治疗的同时，需结合低酪氨酸及苯丙氨酸的饮食治疗。通常<2岁的患儿推荐其总蛋白质摄入量为3 g/（kg·day），随年龄增加该总量逐渐降至2 g/（kg·day），其中天然蛋白质的摄入量婴儿时期控制在2g/（kg·day）以内,至儿童期减为1 g/（kg·day），其余蛋白质则由不含酪氨酸和苯丙氨酸的配方营养粉提供；此外还需给予一定量的维生素及矿物质，定期监测血浆酪氨酸浓度，适时调整饮食治疗方案[22] 。5.3 肝移植 肝移植治疗酪氨酸血症Ⅰ型患者已有20多年历史，移植后患者的急慢性肝损伤好转，凝血功能明显改善，血浆及尿中琥珀酰丙酮等毒性代谢产物浓度显著降低，可有效控制病情，尤其对发生急性肝衰竭或肝细胞癌的患者，可明显改善其预后[22]。但即便在理想条件下，肝移植后患者仍有10%左右的死亡率，且术后需终生进行免疫抑制治疗[10]。因此，目前肝移植在酪氨酸血症Ⅰ型治疗中的应用指征仅限于对尼替西农治疗无效的急性肝衰竭患者以及疑有肝细胞癌者。另外，肝移植对改善患者肾损害的远期影响尚未明确，多数进行肝移植的患者肾小管功能有所改善，但不能完全恢复正常；肝移植后多数患者尿琥珀酰丙酮水平明显降低，但可能因肾脏细胞中FAH缺陷仍然存在，患者尿琥珀酰丙酮水平并不能完全恢复正常[22]。5.4 其他疗法 有学者利用酪氨酸血症Ⅰ型的小鼠模型，通过腺病毒相关病毒介导的基因修复使部分肝细胞的突变基因得到修复，功能恢复正常，患病小鼠的临床症状消除，为酪氨酸血症Ⅰ型患者治疗研究提供了新思路[23]。亦有研究证明，对于新生FAH-/-小鼠，于围产期给予适量谷胱甘肽单乙酯/维生素C治疗，联合尼替西农治疗，亦起到较好疗效[24]。Hoppo等[25]人通过将正常小鼠肝细胞移植注射入FAH基因敲除小鼠腹腔内，发现移植的正常肝细胞在小鼠腹腔淋巴结中存活并克隆，产生功能性肝样变淋巴结，使小鼠存活率提高。综上所述，酪氨酸血症Ⅰ型是一种先天性代谢障碍性疾病，如不及时诊断和治疗，将严重威胁患者的生命。目前该病的诊断主要依据患者肝脏及肾脏功能损害的临床表现，结合血或尿琥珀酰丙酮水平增高。主要治疗方法是尼替西农及低酪氨酸及苯丙氨酸饮食疗法相结合。若治疗及时，患者的临床症状及生活质量可以明显得到改善。

一、什么是苯丙酮尿症苯丙酮尿症（Phenylketonuria，PKU）是一种遗传代谢病，是由于体内苯丙氨酸羟化酶活性降低或其辅酶四氢生物喋呤缺乏，导致苯丙氨酸向酪氨酸代谢受阻，血液和组织中苯丙氨酸浓度增高，尿中苯丙酮酸、苯乙酸和苯乳酸显著增加，故称“苯丙酮尿症”。本病虽为遗传代谢病，但并不少见，我国PKU的患病率约为1:10000,美国约为1：14 000，北爱尔兰约为1/4 400，德国约为1：7 000，日本约为1：78 400。上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书二、苯丙酮尿症是如何引起的苯丙酮尿症是由于体内苯丙氨酸代谢异常引起的。苯丙氨酸是人体生长和代谢所必需的氨基酸，食入体内的苯丙氨酸一部分用于蛋白质的合成，一部分通过苯丙氨酸羟化酶作用转变为酪氨酸，发挥功能。苯丙氨酸羟化酶发挥作用需要四氢生物喋呤作为辅酶才能达到更好的效果。苯丙氨酸羟化酶活性降低或四氢生物喋呤缺乏，均可导致苯丙氨酸不能转变为酪氨酸，从而导致苯丙氨酸及其旁路代谢产物苯丙酮酸、苯乙酸和苯乳酸显著增加，引起脑损伤而发病。苯丙氨酸羟化酶和四氢生物喋呤的产生是由遗传基因决定的。若父母带有异常的苯丙氨酸羟化酶或四氢生物喋呤代谢相关的基因，既父母是苯丙氨酸羟化酶或四氢生物喋呤代谢相关的异常基因的杂合子，但因只带有1个异常基因，所以不发病。母亲怀孕时父母同时将各自的异常基因传给了胎儿，胎儿带有2个异常基因，既纯合子，既可导致发病，所以说这是一种隐性遗传代谢病。三、苯丙酮尿症有哪些异常表现PKU患儿出生时大多表现正常，新生儿期无明显特殊的临床症状。未经治疗的患儿3～4个月后逐渐表现出智力、运动发育落后，头发由黑变黄，皮肤白，全身和尿液有特殊鼠臭味，常有湿疹。随着年龄增长，患儿智力低下越来越明显，年长儿约60%有严重的智能障碍。2/3患儿有轻微的神经系统体征，例如，肌张力增高、腱反射亢进、小头畸形等，严重者可有脑性瘫痪。约1/4患儿有癫痫发作，常在18个月以前出现，可表现为婴儿痉挛性发作、点头样发作或其他形式。约80%患儿有脑电图异常，异常表现以痫样放电为主，少数为背景活动异常。经治疗后血苯丙氨酸浓度下降，脑电图亦明显改善。四、若怀疑苯丙酮尿症需要哪些做检查若患儿有上述异常表现，需要做如下检查，以便诊断。（一）血苯丙氨酸测定由于苯丙酮尿症首先表现为血中苯丙氨酸浓度的升高，所以检测血中苯丙氨酸浓度是诊断PKU的首选方法，一般血苯丙氨酸³120mmol/L，判断为阳性，再做进一步诊断，若能够同时检测血酪氨酸浓度更好，可分析苯丙氨酸与酪氨酸的比值，³2判断为阳性，目前串联质谱可快速检测苯丙氨酸与酪氨酸浓度，并自动计算其比值，可降低假阳性率或假阴性率。（二）尿液蝶呤谱分析由于四氢生物喋呤缺乏可在尿液中的喋呤谱反映出来，故检测尿液中喋呤谱，有助于PKU分型。（三）血红细胞二氢生物喋啶还原酶活性测定由于部分患儿四氢生物喋呤缺乏是由于二氢生物喋啶还原酶活性缺乏引起，故测定血红细胞二氢生物喋啶还原酶活性有利于二氢生物喋啶还原酶缺乏症的诊断。（四）头颅核磁共振检查新生儿筛查诊断的患儿由于还未发病，无临床症状，故一般不需要做头颅核磁共振检查。有临床症状的患者，需要做头颅核磁共振检查，以便判断大脑损伤情况。PKU患者脑影像学改变主要为髓鞘化发育延迟和T2加权图像上脑白质内散在斑片状高信号灶，多累及脑室周围白质和额、顶、枕叶。部分患儿还有脑灰白质分化不良、胼胝体发育不良、透明隔缺如、弥漫性和局灶性脑萎缩等。五、苯丙酮尿症是如何诊断和分型的（一）苯丙酮尿症如何诊断患者苯丙酮尿症的诊断是依据患儿有智力低下、头发黄、肤色白、运动、语言发育落后的症状，化验血苯丙氨酸增高即可诊断。只是目前在有些地方，医生对本病认识不足，遇到这样的病人，未能够想到此病，不做相关的检查，常导致漏诊或误诊，故本病需引起广大医生的重视。目前开展的新生儿疾病筛查，可使PKU在发病前即得到诊断，及早进行了治疗，故发病的PKU患儿较以往少见。（二）苯丙酮尿症的分型诊断苯丙酮尿症只是完成了部分诊断，由于引起本病的发病机制导致苯丙酮尿症有不同的类型，不同的类型治疗方法也不同，所以一旦确诊PKU，需要及早分型。首先经尿蝶呤分析和红细胞二氢蝶啶还原酶活性测定分为四氢蝶呤代谢正常和异常2大类。四氢蝶呤代谢正常的PKU有如下4种类型：（1）经典型PKU：苯丙氨酸浓度³1 200mmol/L，对四氢生物喋呤治疗无效。（2）轻度高苯丙氨酸血症：血苯丙氨酸浓度在120mmol/L～360mmol/L。 （3）中度高苯丙氨酸血症：血苯丙氨酸浓度360mmol/L～1 200mmol/L。(4)四氢生物喋呤反应性苯丙酮尿症：对四氢生物喋呤治疗有效的苯丙酮尿症。四氢蝶呤代谢异常的PKU有3类：(1)6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶缺乏型：尿新喋呤浓度升高，生物喋呤浓度下降，血苯丙氨酸升高，对四氢生物喋呤治疗有效。（2）二氢蝶啶还原酶缺乏型：血红细胞二氢蝶啶还原酶活性下降，血苯丙氨酸升高或正常，升高者对四氢生物喋呤治疗有效，血红细胞二氢蝶啶还原酶活性下降。（3）鸟苷三磷酸环化水解酶I缺乏型：尿新喋呤浓度及生物喋呤浓度均下降，血苯丙氨酸升高或正常，升高者对四氢生物喋呤治疗有效。六、苯丙酮尿症如何治疗及预后如何苯丙酮尿症的治疗需要根据分型采取针对的治疗措施。（一）经典性PKU、中度高苯丙氨酸血症和中轻度高苯丙氨酸血症的治疗：这3种类型是由于苯丙氨酸羟化酶本身异常导致，但目前尚缺乏苯丙氨酸羟化酶这种药物，故只能通过减少从食物中摄取苯丙氨酸的方法，使体内苯丙氨酸浓度控制在合适的水平。由于普通食物，尤其是含蛋白质较高的食物，如肉、鱼、、虾、蛋及豆制品等，含有较高的苯丙氨酸，故需减少这些食物的食入，给予不含苯丙氨酸的配方奶粉或蛋白粉，以便提供体内必需的氨基酸。但苯丙氨酸又是人体的必需氨基酸之一，必须满足其生长发育的需要，体内苯丙氨酸过低也可导致疾病。因此，患者每天的苯丙氨酸摄入量必须维持在不引起脑损害和满足生长发育所需量之间。有研究发现PKU患者的发育商（DQ）或智商（IQ）与患者在治疗过程中的血苯丙氨酸水平呈反相关关系，血苯丙氨酸的要求浓度随着年龄的增长而不同，一般要求血苯丙氨酸维持范围为：0～3岁 120～240 mmol/L ；3～8岁180～360 mmol/L；8～13岁180～480 mmol/L；13～18岁180～600 mmol/L；>18岁180～900 mmol/L。定期复查血苯丙氨酸浓度，根据苯丙氨酸浓度是否在合适的范围，调整每日食入不含苯丙氨酸的配方奶粉或蛋白粉的量。（二）四氢生物喋呤反应性苯丙酮尿症：可按上述给予不含苯丙氨酸的特殊奶粉或蛋白粉治疗，也可用四氢生物喋呤治疗，只是用四氢生物喋呤费用较高，不同患者家庭可根据经济情况选择治疗方法，但血苯丙氨酸的控制水平要求同上。（三）6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶缺乏型及二氢蝶啶还原酶缺乏型的治疗。由于这2种类型不是由于苯丙氨酸羟化酶活性缺乏引起，而是由于四氢生物蝶呤缺乏引起，故需服用四氢生物蝶呤治疗，不需要给予特殊奶粉治疗。但由于四氢生物蝶呤缺乏同时可引起神经递质的缺乏，故需要同时给予5-羟色胺及左旋多巴治疗。（四）苯丙酮尿症预后如何苯丙酮尿症患儿若不治疗或治疗较晚，大部分患儿均有智力、运动和语言发育落后，若能够在症状出现之前进行诊断和治疗，即通过新生儿疾病筛查诊断的PKU患儿，诊断后及时治疗，近90％患儿智力可达到正常，只有少部分患儿由于治疗不够配合或病情较重，血苯丙氨酸浓度控制不理想，仍可导致智力下降。出生后1个月内接受治疗者多数可以不出现智力损害，治疗越晚，对脑的损伤越明显。因此，患儿一旦确诊，应立即给予治疗，治疗越早，预后越好。日本学者大浦敏明等研究了PKU患者的初诊年龄与DQ/IQ的关系，研究结果表明，随着初诊年龄的推移，DQ/IQ越来越低，但以初诊年龄在出生后3～18个月者DQ/IQ的下降程度最明显。美国Jervis收集了欧美新生儿疾病筛查开始以前的3岁以上的PKU患者的DQ/IQ，有近80%的患者IQ低于30，为重度智力低下患者。日本虽有若干轻型患者，但仍有约70%的患者IQ低于50，为中度或重度智力低下患者七、可否预防苯丙酮尿症苯丙酮尿症是可以预防的。这里所说苯丙酮尿症的预防包括2个方面：一是预防苯丙酮尿症的发病，二是预防苯丙酮尿症患儿的出生。（一）预防苯丙酮尿症的发病预防苯丙酮尿症的发病必须早期诊断、早期治疗从而避免因过高苯丙氨酸代谢产物苯丙酮酸、苯乙酸和苯乳酸导致神经系统的损伤。由于体内苯丙酮酸、苯乙酸和苯乳酸积蓄到损伤大脑所需的浓度需要一定的时间，所以即使是PKU患儿，但在新生儿出生后1～2个月内往往仅是这些异常代谢产物浓度所增加，还不至于引起不可逆的损伤。若在这一阶段及时诊断和有效治疗即可避免神经系统受到损伤。这种在婴儿出生后1个月之内，还未发病之前检测疾病的方法称为新生儿疾病筛查，是早期诊断的有效方法，既在新生儿出生3天后采血，检测血苯丙氨酸浓度，若苯丙氨酸增高，需要进一步确诊检查，确诊后进行有效治疗，血中苯丙氨酸及其异常代谢产物降至正常，达到预防发病的目的。（二）预防苯丙酮尿症患儿的出生预防苯丙酮尿症患儿的出生既在患儿出生前胎儿时期进行诊断，若诊断为苯丙酮尿症由父母决定是否保留改患病胎儿，这种在出生前诊断的方法称为产前诊断。苯丙酮尿症的产前诊断适用于已经有PKU患者的父母再想生育者。方法为：首先检测出患儿及患儿父母血细胞中的致病基因突变位点，这是产前诊断PKU的前提，然后在母亲再次怀孕16～20周时抽取羊水，检测羊水中胎儿的细胞中是否带有2致病基因突变位点，若带有2致病基因突变位点既是PKU患儿，若只带有1个致病基因突变位点，既是致病基因携带者。这样可以进行产前诊断，由父母决定胎儿的去留，可以达到预防苯丙酮尿症患儿的出生的目的。综上所述苯丙酮尿症是一种可以治疗的遗传代谢病，早期治疗效果较好。并且可以通过新生儿疾病筛查，做到发病前诊断，及时治疗，预防发病。对于已经有PKU患儿的家庭，若患儿父母再想要孩子，可以通过产前诊断判断胎儿是否患有苯丙酮尿症。上海交通大学医学院附属新华医院上海市儿科医学研究所韩连书

临床儿科杂志, 2008, 26:724-727王斐综述 韩连书审校（上海交通大学医学院附属新华医院 上海市儿科医学研究所，内分泌遗传代谢病研究室，上海200092）摘要： 甲基丙二酸血症是一种常见的有机酸血症，属于常染色体隐性遗传，临床表现无特异性，以呕吐、嗜睡等神经系统症状为主。诊断依靠串联质谱检测血中的酰基肉碱和气相质谱检测尿甲基丙二酸。对伴有同型半胱氨酸血症患儿，治疗以维生素B12、甜菜碱和左旋肉碱为主；对不伴有同型半胱氨酸血症患儿以限制天然蛋白质摄入，给予去除异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸的特殊奶粉及左旋肉碱治疗为主。维生素B12治疗有效型预后较好，维生素B12治疗无效型预后较差。上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书关键词： 甲基丙二酸血症；诊断；治疗Progress of Diagnosis and Therapy in Methylmalonic Acidemia WANG Fei , HAN Lian-shu(Department of Pediatric Endocrinology and Genetic Metabolism, Shanghai Institute for Pediatric Research, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medical, Shanghai 200092, China)Abstract： Methylmalonic acidemia is an autosomal recessive organic acidemia, which is charactered by various presentations, especially the neurological symptoms such as vomiting, lethargy and so on. The diagnosis of this disease depends on the measurement of acylcarnitine in the blood by gas-chromatography mass spectrometry and the detection of methylmalonic acid in the urine by tandem mass spectrometry. The patients with methylmalonic acidemia and homocystinuria should be mainly treated with vitamin B12, betaine and L-carnitine, while the patients with isolated methymalonic acidemia should be treated with protein restriction, the special milk formula without isoleucine, valine, methionine, and threonine, and be given L-carnitine. Compared with the vitamin B12-nonresponsive patients, the vitamin B12-responsive ones have better outcome.Key words： methylmalonic acidemia；diagnosis；treatment 甲基丙二酸血症（methylmalonic acidemia, MMA）是一种常见的有机酸血症，属于常染色体隐性遗传病。主要是由于甲基丙二酰辅酶A变位酶（methylmalonyl-CoA mutase, MCM）或其辅酶钴胺素代谢缺陷所致。1967年，Oberholzer和Stokke分别报道了首例MMA患者。其患病率美国为1：48,000；意大利患病率为1：115,000；德国为1：169,000[1]；日本为1：50,000。国内患病率尚不清楚，但对临床疑似患儿进行串联质谱检测发现，甲基丙二酸血症患儿并不少见[2,3]，为此对MMA近几年诊治研究进展进行探讨，以助于提高儿科医生对本病的认识，使更多的患儿得到及时诊断和治疗。1 甲基丙二酸血症病因及分型甲基丙二酸是异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、胆固醇和奇数链脂肪酸分解代谢途径中甲基丙二酰辅酶A的代谢产物，正常情况下在MCM及AdoCbl的作用下转化生成琥珀酸，参与三羧酸循环。MCM缺陷或AdoCbl代谢障碍导致甲基丙二酸、丙酸、甲基枸橼酸等代谢物异常蓄积，引起神经、肝脏、肾脏、骨髓等多脏器损伤[4]。根据酶缺陷的类型分为MCM缺陷及其辅酶钴胺素（VitB12）代谢障碍两大类。MCM又分为无活性者为mut0型，有残余活性者为mut-型。辅酶钴胺素代谢障碍包括：腺苷钴胺素合成缺陷，即线粒体钴胺素还原酶缺乏（cblA）和钴胺素腺苷转移酶缺乏（cblB）；以及3种由于胞浆和溶酶体钴胺素代谢异常引起的腺苷钴胺素（adenosylcobalamin, AdoCbl）和甲基钴胺素（methylcobalamine, MeCbl）合成缺陷（cblC、cblD和cblF），这3种类型患者除有甲基丙二酸血症外，还伴有同型半胱氨酸血症，是中国甲基丙二酸血症常见类型[5]。2 甲基丙二酸血症的诊断2.1 临床诊断甲基丙二酸血症患儿临床表现各异，往往易于误诊，最常见的症状和体征是嗜睡、生长障碍、反复呕吐、脱水、呼吸困难及肌张力低下。根据维生素B12负荷试验结果，分为VitB12有效型和无效型。即连续三天肌内注射VitB12 1mg/d，若症状好转，生化异常改善，则为VitB12有效型。VitB12有效型：多为cblC、cblD、cblF型，cb1A、cb1B型部分有效。其中cblC型患儿最常见，主要表现为巨幼红细胞贫血、生长障碍及神经系统症状。其中早发型多于1岁内起病，迟发型多在4 岁以后出现症状，可合并多系统损害[6]。cblD型患儿发病较晚，无血液系统异常表现。cblF型患儿新生儿期出现口腔炎、肌张力低下和面部畸形，部分有血细胞形态异常。VitB12无效型：是MMA新生儿期发病最常见的类型，多由于变位酶缺陷引起。出生时可正常，可迅速进展为嗜睡、呕吐并有脱水，继而出现代谢性酸中毒、呼吸困难、肌张力低下并发脑病。mut0型患儿比其他类型更早出现症状，80%出生第一周发病。此外，也有报道一些无症状的“良性”甲基丙二酸血症患者，尿中甲基丙二酸排泄量轻度增加，其长期预后以及临床表现型还有待进一步研究[7]。MMA并发症与患病类型、发病年龄以及对维生素B12的反应性有关。mut0与cb1B型较mut-与cb1A并发症更为常见[8]。主要表现为：①神经损伤：尤其是脑损伤，大多位于双侧苍白球，可表现为惊厥，运动功能障碍，以及舞蹈手足徐动症等[9]。②智力障碍：有报道约50%mut0型、25%cb1A及cb1B型患儿的IQ<80。大于4岁的患者中约59% iq="">75，41% IQ>90 [8]。③生长发育障碍：大多患儿体格发育落后，尤其是新生儿期发病的患儿和mut-患儿，可见小头畸形。④肝肾损伤：部分患儿出现肝脏肿大及肾小管酸中毒、间质性肾炎、慢性肾衰等[9]。mut0和cb1B型多见慢性肾衰，其次是cb1A，mut-较少见[10]。⑤血液系统异常：多见巨幼细胞性贫血、粒细胞及血小板减少，严重时出现骨髓抑制。⑥免疫功能低下：少数患儿易合并皮肤念珠菌感染，常见口角、眼角、会阴部皲裂和红斑，少数合并口炎、舌炎、肠病性肢皮炎等。⑦其他：患儿可并发肥厚性心肌病或血管损害（尤其合并同型半胱氨酸血症患儿），急慢性胰腺炎以及骨质疏松。2.2 实验室诊断2.2.1 一般检查 可见代谢性酸中毒、乳酸增加、电解质紊乱，白细胞、血红蛋白及血小板减少，血糖降低、血氨升高、尿酮体及尿酸升高，肝肾功能异常等。2.2.2 特殊检测 通过气相-色谱质谱（gas-chromatography mass spectrometry, GC-MS）检测尿、血、脑脊液中有机酸和串联质谱（tandem mass spectrometry, MS/MS）检测血丙酰肉碱（propinoylcarnitine, C3）是确诊本症的首选方法。MMA患者尿液中甲基丙二酸、甲基枸橼酸和3-羟基丙酸显著增加。血液中C3、C3/C0（游离肉碱）和C3/C2（乙酰肉碱）升高[2,3]。在单纯甲基丙二酸血症患儿中，尿甲基丙二酸浓度为270~13 000mmol/mol·肌酐（正常儿童<2 mmol/mol·肌酐）；血中甲基丙二酸浓度约为220～2900mmol/L（正常范围<0.2mmol/l）。部分患儿的脑脊液中检测到与血浆等量的甲基丙二酸[7]。血、尿同型半胱氨酸测定，甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症患儿血清和尿液同型半胱氨酸浓度增高，单纯甲基丙二酸血症患儿正常，可进行鉴别[5]。2.2.3 酶学分析 可通过皮肤成纤维细胞、外周血淋巴细胞或肝组织纤维母细胞，酶活性检测、互补实验等分析确定MMA酶缺陷类型。①MCM活性检测：在加入OH-Cb1（1μg/ml）以及AdoCb1（50~100μM）的条件下，通过[14C]甲基丙二酰-CoA到[14C]琥珀酰-CoA的转化，检测MCM活性[8,11]。②钴胺素缺陷定位：通过成纤维细胞摄取[57Co]-氰基钴胺素的研究，以及互补实验来确定特殊的Cbl互补类型[12]。2.2.4 基因检测 基因突变分析是MMA分型最可靠依据。其中MCM编码基因为MUT，定位于6p21.1；cb1A 基因被定义为MMAA，位于4q31.1-q31.2；cblB基因定义为MMAB定位于12q24；cblC编码基因命名为MMACHC，位于1p34.1。通过对以上几种类型基因突变的检测，可明确分型。2.3 其他辅助诊断方法2.3.1 影像学检查 甲基丙二酸血症患儿脑CT、MRI 扫描常见对称性基底节损害。MRI 显示双侧苍白球信号异常，可表现为脑白质脱髓鞘变性、软化、坏死、脑萎缩、脑积水等。2.3.2 病理活检 甲基丙二酸血症患者脑组织病理分析可见脑萎缩、弥漫性神经胶质细胞增生、星形细胞变性、脑出血、苍白球坏死、髓鞘化延迟、丘脑及内囊细胞水肿、空泡形成等。2.3.3 脑电图 近来发现MMA伴惊厥患儿脑电图主要呈高峰节律紊乱、慢波背景伴痫样放电，而无惊厥患儿脑电图为局灶性样放电和慢波背景。动态脑电图监测对评估MMA患儿脑功能、维生素B12疗效，及抗癫痫药物治疗都是有意义的[13]。2.3.4 产前诊断 妊娠12～16周时可测定培养羊水细胞或绒毛膜细胞中MCM活性以及钴胺素代谢物，通过GC-MS或MS/MS对羊水或母尿中可定量分析甲基丙二酸和酰基肉碱，15~18孕周经羊水穿刺或10~12孕周经绒毛膜绒毛取样提取胎儿细胞的DNA，可对突变已知家系进行基因产前诊断[14,15]。3 甲基丙二酸血症的治疗及预后治疗原则为减少代谢毒物的生成和/或加速其清除，主要方法包括限制某些饮食摄入以及通过药物、器官移植等方法进行治疗。3.1 MMA急性期治疗 甲基丙二酸血症急性期治疗应以补液、纠酸为主，同时应限制蛋白质摄入，供给适当的热量。如果出现低血糖，可先行静脉注射葡萄糖1~2g/kg，随后补充10%的葡萄糖溶液[1]。若持续高氨血症（血氨>600μmol/L），则需要通过腹透或血液透析去除毒性代谢物。为稳定病情可用左旋肉碱，100～300mg/kg/d，静滴或口服；VitB12，1mg/d，肌注，连续3～6天。3.2 MMA长期治疗3.2.1 饮食治疗 原则是低蛋白、高能饮食，减少毒性代谢产物蓄积。使用不含异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸和蛋氨酸的特殊配方奶粉或蛋白粉[16]。由于这些氨基酸为必需氨基酸，故特殊配方奶粉不能作为蛋白质的唯一来源，应进食少量天然蛋白质。维生素B12无效型患儿以饮食治疗为主，天然蛋白质摄入量控制在0.8~1.2g/kg/d，蛋白质总摄入量婴幼儿期应保证在2.5～3.0g/kg/d，儿童每天30～40g，成人每天50～65g，不足部分由特殊奶粉或蛋白粉补充。维生素B12有效型患儿蛋白饮食限制不需过于严格，尤其对于合并同型半胱氨酸血症患儿，维生素B12治疗效果显著，大部分患儿不需要特殊奶粉治疗，对于确实需要者，由于自身蛋氨酸合成障碍，在使用过程中需要监测血液中蛋氨酸浓度，以防蛋氨酸缺乏[5]。3.2.2 药物治疗 ①维生素B12：用于维生素B12有效型的长期维持治疗，每周肌内注射1mg，1~2次，部分患儿可口服甲基钴胺素500～1000μg/d。也有研究提出肌注钴胺素较口服更能有效地降低同型半胱氨酸以及甲基丙二酸的水平[17]。羟钴胺治疗后，约90%的cb1A患儿症状好转，40%的cb1B患儿体内甲基丙二酸水平降低。②左旋肉碱：促进甲基丙二酸和酯酰肉碱排泄，增加机体对自然蛋白的耐受性，常用剂量为50~100mg/kg/d，急性期可增至300mg/kg/d，口服或静脉滴注。③甜菜碱：用于合并同型半胱氨酸血症患儿，500～1000mg/d，口服。④叶酸：用于合并贫血或同型半胱氨酸血症患儿，10～30mg/d，口服。⑤维生素B6：12～30mg/d，口服。⑥甲硝唑（10~20mg/kg, tid）或新霉素（50mg/kg, tid），可减少肠道细菌产生的丙酸，但长期应用可引起肠道菌群紊乱，应慎用。⑦氨基甲酰谷氨酸（50~100mg/kg/d）以及苯甲酸钠（150~250mg/d）治疗，可改善高氨血症以及高甘氨酸血症。⑧应急时使用胰岛素或生长激素，可增加蛋白及脂质合成并改善体内代谢。3.2.3 肝、肾移植治疗 对于维生素B12无效型且饮食控制治疗效果较差的患者可尝试肝脏移植治疗。研究表明肝移植仅能部分纠正MMA代谢缺陷，不能预防肾脏以及神经退行性病变的进展[18]。肾移植可纠正肾衰并在一定程度上减少甲基丙二酸浓度。也有研究认为肝-肾联合移植可能比单独肝移植要好，但其长期预后及移植存活率仍不确定[4]。3.3 预后甲基丙二酸血症患儿的预后主要取决于疾病类型、发病早晚以及治疗的依从性。维生素B12有效型预后较好，其中cblA 型预后最好，70%健康生存；维生素B12 无效型预后不佳，mut0 型预后最差，60%死亡，40%发育显著迟缓。新生儿发作型患儿死亡率达80%[10]，迟发型患儿临床进程较稳定且程度较轻。近年来，甲基丙二酸血症患儿预后明显改善，死亡率有所下降。mut0型患儿一年生存率由70年代的65%上升到90年代的90%，五年生存率也由33%上升到80%。患儿死亡年龄平均为2岁（5天~15岁），总死亡率为36%。近年来随着诊断技术的提高和新生儿疾病筛查的普及，甲基丙二酸血症的诊断越来越早，有利于早期有效的治疗并改善长期预后。鉴于甲基丙二酸血症患儿临床表现各异，且分型诊断较为复杂，故其具体发病机制以及临床诊治方法有待进一步深入研究。

韩连书 叶军 邱文娟 张惠文 高晓岚 王瑜 李筱燕 许浩 顾学范上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书临床儿科杂志, 2012, 30(9):806-809.【摘要】 目的 了解中国新生儿期发病的氨基酸、有机酸和脂肪酸氧化代谢病的的疾病谱，有助于提高儿科医生对这些疾病的认识。 方法 对2003年2月~2012年5月来自全国的2547例遗传性代谢病疑似新生儿，进行血串联质谱和尿气相色谱检测，对确诊的127例患儿的疾病谱及临床表现进行分析。结果 在2547例新生儿患儿中诊断氨基酸、有机酸和脂肪酸氧化代谢病127例（5%）。其中氨基酸代谢病38例（29.1％），以鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症（16例）和枫糖尿病（14例）多见；有机酸代谢病76例（59.8％），以甲基丙二酸血症（50例）最常见，其次为丙酸血症（13例）和异戊酸血症（10例）；脂肪酸氧化代谢病14例（11.0％），以多种辅酶酰基A脱氢酶缺乏症多见（6例）。结论 新生儿期甲基丙二酸血症最常见，其次为鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症、枫糖尿病、丙酸血症和异戊酸血症。儿科医生尤其是新生儿科医生需要重视利用串联质谱和气相质谱进行遗传代谢病检测，早诊断早治疗。【关键词】 新生儿；遗传代谢病；串联质谱；气相质谱Diseases spectrum analysis of amino acid, organic acid and fatty acid oxidative metabolism disease in newborns【Abstract】 Objective To investigate the spectrum of neonatal-onset metabolic diseases such as amino acid diseases, organic acidemias and fatty acid oxidation disorders, so as to help pediatricians improve the awareness of these diseases. Methods From February 2003 to May 2012, 2547 neonates suspected with inherited metabolic disorders from all over China were tested by tandem mass spectrometry (MS/MS) and gas chromatography mass spectrometry (GC-MS). For the 127 confirmed cases, the analysis of disease spectrum and clinical manifestations was made. Results 127 cases (5%) with metabolic diseases were diagnosed from the 2547 cases. 37 cases (29.1%) were amino acid metabolic diseases, among which ornithine transcarbamylase deficiency (16 cases) and maple syrup urine disease (14 cases) were common. 76 cases (59.8%) were organic acid metabolic diseases, among which methylmalonic acidemia (50 cases) was the most common, followed by propionic acidemia (13 cases) and isovaleric acidemia (10 cases). Another 14 cases (11%) were fatty acid oxidation disorders, among which multiple CoA carboxylase deficiency (6 cases) was common. Conclusion In the newborn period, methylmalonic acidemia was the most common disease, followed by ornithine transcarbamylase deficiency, maple syrup urine disease, propionic acidemia and isovaleric academia. Pediatricians, especially neonatologists, should pay attention to the utilization of MS/MS and GC-MS to detect inherited metabolic disorders, which is helpful for early diagnosis and early treatment.【Key words】neonates, inherited metabolic disorders, tandem mass spectrometry, gas chromatography mass spectrometry遗传性代谢病（inherited metabolic disorders, MD）或称先天性代谢缺陷病（inborn errors of metabolism, IEM）是由于遗传性代谢途径缺陷，导致异常代谢物质的蓄积或必需物质的缺乏，而出现相应的实验室检查异常和临床症状的一类疾病，包括氨基酸、有机酸、脂肪酸、糖和激素等多种物质的代谢异常，目前已报道的疾病种类多达500余种。虽然单一病种患病率低，但种类繁多，总体发病率约在1/2555~1/784[1]。其中部分疾病在新生儿期发病，临床表现无特异性，常表现为嗜睡、喂养困难、呼吸暂停、肌张力增高或减低、代谢性酸中毒和高氨血症等，诊断困难。近几年开展的血串联质谱和气相质谱技术可检测40余种氨基酸、有机酸和脂肪酸氧化代谢病[2]。本研究室于2002年率先引进串联质谱技术对氨基酸、有机酸和脂肪酸代谢紊乱等遗传代谢病进行临床研究[3]。本文分析2003年2月至2012年5月本研究室应用串联质谱仪和气相色谱-质谱仪检测并确诊的127例患儿，氨基酸、有机酸和脂肪酸氧化代谢病的疾病种类，探讨我国哪些疾病在新生期发病率较高，以期提高儿科医生对于氨基酸、有机酸和脂肪酸氧化代谢病的认识，做到早期诊断、早治疗。1. 对象与方法1.1 对象来自全国各地100余所医院的疑似遗传性代谢病新生儿2547例，主要来自属于三级甲等医院的儿童医院或儿科（包括澳门仁伯爵和镜湖医院），其中男1647例，女900例，年龄在1 d～30d。标本采集用干血滤纸片法，足跟采血，滴于专用采血滤纸上，晾干后送检。尿为新鲜尿或尿滤纸片。所有检测均经过本院伦理委员会批准并取得家长的知情同意。1.2 方法1.2.1 串联质谱检测方法：串联质谱检测干血滤纸片中酰基肉碱和氨基酸的方法参考文献[3,4]报道的方法，干血滤纸片经含氨基酸和酰基肉碱内标的甲醇萃取，盐酸正丁醇衍生后，利用串联质谱仪进行检测。1.2.2 气相色谱-质谱检测方法：气相色谱-质谱尿有机酸检测方法参考文献[5]报道的方法，尿样经尿素酶、盐酸羟铵、氢氧化钠和盐酸处理，除去尿素及蛋白质，并加入17烷酸作为内标，用乙酸乙酯两次萃取，再用双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷混合物进行甲基硅烷化衍生后，进行气相色谱-质谱检测。1.2.3 疾病诊断：疾病的诊断主要依据各种疾病的发病机制，由串联质谱和气相色谱-质谱检测的相应特异指标，参考文献报道进行判断[6,7]，结合临床表现、常规的实验室检查及相应的治疗效果进行综合诊断，部分患儿经过基因突变检测确诊。2. 结果2.1 检测结果及临床资料分析在2547例新生儿患儿中，诊断127例（5.0%）共17种遗传代谢病，男84例，女43例，年龄中位数9天（1天～30天）。其中氨基酸代谢病7种37例（29.1％），见表1，有机酸血症5种76例（59.8％），见表2，脂肪酸氧化代谢病5种14例（11.0％）。常见临床表现为：喂养困难87例（70.0％）、抽搐（58例，45.3％）和肌张力低下（47例，36.7％）。除上述异常外，部分疾病具有相对特异性表现，如异戊酸血症患儿多有特殊汗脚味。鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症和瓜氨酸血症1型表现为嗜睡或昏迷，血氨显著增高。有机酸血症患儿无特异性表现，以酸中毒和神经系统损害表现为主，常规实验室检测以酸中毒(49例，64.5%)、高乳酸血症（14例，18.4％）和尿酮体阳性(8例，10.5%)。多种羧化酶缺乏症患儿多伴有严重的皮疹、眼角、口角及肛周糜烂。头颅CT或核磁共振检查表现为不同形式的脑损害。脂肪酸氧化代谢病患儿主要为进行性的肌张力减退、嗜睡或昏迷等，实验室检查肌酸激酶增高为其特点。2.2 氨基酸代谢病患儿临床特点及特异检测指标氨基酸代谢病患儿临床表现及主要异常指标见表1。鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症最多见，其次为枫糖尿病和瓜氨酸血症-I型。鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症患儿主要表现为高血氨（6例>500umol/L）、昏迷，血气分析多数正常；血串联质谱示瓜氨酸降低，尿气相质谱结果示乳清酸和尿嘧啶升高。枫糖尿病患儿临床症状较重，多变现为肌张力增高，角弓反张、双下肢“剪刀样”交叉，伴酸中毒，头颅MRI提示脑损伤，6例死亡。表2 氨基酸代谢病患儿37例临床特点及血尿特异性指标氨基酸代谢病种类例数主要临床表现血尿异常指标死亡鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症16黄疸、高血氨、呼吸暂停、血瓜氨酸↓5反复抽搐、嗜睡、昏迷尿乳清酸、尿嘧啶↑枫糖尿病14反应差、嗜睡、肌张力增高血亮氨酸、缬氨酸↑6酸中毒、尿焦糖样气味尿2-酮-异己酸、2-酮异戊酸、2-酮-3-甲基戊酸↑瓜氨酸血症-I型4反应差、喂养困难、昏迷血瓜氨酸↑0肌张力增高尿乳清酸、尿嘧啶↑希特林蛋白缺乏症1圆胖脸、肝大、黄疸血瓜氨酸、蛋氨酸及0酪氨酸↑氨甲酰磷酸合成酶缺乏症1反应差、喂养困难谷氨酸↑瓜氨酸↓06-氧合脯氨酸尿症1拒乳、反应差脯氨酸↑尿氧合脯氨酸↑02.3 有机酸血症患儿临床特点有机酸血症患儿临床表现见表2。甲基丙二酸血症（Methylmalonic Acidemias，MMA）最多见，其次为丙酸血症（Propionic Acidemia，PA)和异戊酸血症。甲基丙二酸血症和丙酸血症患儿临床多表现为喂养困难、难治性酸中毒、嗜睡、抽搐等，二者临床表现无明显差异，病情危重，MMA患儿死亡15例（30%），PA患儿死亡2例（15.4%）。串联质谱检测MMA和PA均表现为丙酰肉碱增高。另外，PA患者伴甘氨酸增高，尿3-羟基丙酸及甲基枸橼酸增高，MMA患者尿中甲基丙二酸及甲基枸橼酸升高。异戊酸血症患儿10例，多出现抽搐、肌张力异常、特殊汗脚味，死亡5例（50%）。戊二酸血症-I型患儿表现为低血糖、酸中毒、脑水肿。血尿检测异常指标见表2。表2 有机酸血症患儿76例临床特点及血尿特异性指标有机酸代谢病种类例数主要临床表现血尿异常指标死亡甲基丙二酸血症50喂养困难、难治性酸中毒血丙酰肉碱↑15反复抽搐、嗜睡、昏迷尿甲基丙二酸、甲基枸橼酸↑丙酸血症13反应差、嗜睡、肌张力异常血丙酰肉碱、2呼吸暂停、酸中毒甘氨酸↑尿3-羟基丙酸及甲基枸橼酸↑异戊酸血症10喂养困难、特殊汗脚味血异戊酰肉碱↑5抽搐、肌张力增高或低下尿异戊酰甘氨酸↑戊二酸血症-I型2低血糖、酸中毒、脑水肿血戊二酰肉碱↑1尿戊二酸↑多种辅酶A羧化酶缺乏症1皮疹、口角糜烂血3-羟基异戊酰肉碱↑1尿甲基巴豆酰甘氨酸↑2.4 脂肪酸氧化代谢病患儿临床特点及特异检测指标脂肪酸氧化代谢病相对氨基酸或有机酸代谢病少见，共计14例（10.9%），其中多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症6例，短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症3例，原发性肉碱缺乏症2例，极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症2例，肉碱棕榈酰转移酶II缺乏症1例。临床表现主要有呕吐、低血糖、反应差等。短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症以丁酰肉碱增高为主，多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症以辛酰肉碱增高为主，极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症以肉豆蔻烯酰肉碱和肉豆蔻酰肉碱增高为主，肉碱棕榈酰转移酶II缺乏症以棕榈酰肉碱增高为主。尿气相色谱-质谱有机酸检测短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症患者显示乙基丙二酸增高，其他疾病患者表现为多种二羧酸增高。3. 讨论新生儿期发病的遗传代谢病患儿，发病急，进展快，由于无特异性临床表现，多被误诊为败血症、缺氧缺血性脑病等，治疗效果不佳。因此，在临床工作中，对所有的危重新生患儿，临床医生都要警惕遗传代谢病的可能性。在新生儿期发病的遗传代谢病，多为氨基酸、有机酸和脂肪酸氧化代谢病。近年来，随着串联质谱仪的应用，临床医生逐步加深了对遗传代谢病的认识，使得遗传代谢病患者检出率较前明显提高。Zytkovicz等[8]研究表明，50％的遗传代谢确诊病例来源于只占人口总数5％的NICU人群，说明NICU人群是遗传代谢病发生的高危人群。通过我们的统计，在2547例遗传代谢病疑似新生儿中检出氨基酸、有机酸和脂肪氧化代谢病患儿共128例，检出率为5.0%，表明较高的患病率。其中有机酸血症患儿占59.4%，提示有机酸血症在中国新生儿遗传代谢病中比较多见。氨基酸代谢病患儿38例（占所有诊断病例的29.7%），仅次于有机酸血症患儿。脂肪酸b氧化代谢病在欧美国家的患病率较高,中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症最多见[9]，本研究仅检测到脂肪酸氧化代谢病14例（占所有诊断病例的10.9%），提示脂肪酸氧化代谢病在中国新生儿期患病较少见。香港地区新生儿筛查发现氨基酸代谢病、有机酸代谢病和脂肪酸的患病率之比约为5:1:1，与本研究有所差异[10]，原因可能为前者为新生儿筛查确诊患儿，本研究为新生儿期发病患儿，说明部分氨基酸代谢病在新生儿期并没有发病。有机酸代谢障碍是由于氨基酸、脂肪及糖代谢途径中某种酶的缺陷，导致其中间代谢产物有机酸增加，有机酸过多的蓄积造成神经系统及其他脏器损害，严重时出现酸中毒、低血糖和高血氨等。甲基丙二酸血症在有机酸代谢障碍中最常见，其次是丙酸血症和异戊酸血症。国外大样本筛查结果表明，甲基丙二酸患者的发病率在1/169 000~1/48 000[11]之间；本研究室利用串联质谱筛查40余万例新生儿，结果显示甲基丙二酸血症患病率为1/33 000。本组研究中，甲基丙二酸患儿占有机酸血症的65.8%，表明在中国甲基丙二酸血症是最常见的有机酸血症。主要表现为嗜睡、反应差、抽搐等神经系统症状，实验室检查常提示代谢性酸中毒、高血氨；病情进展迅速，短期内出现代谢危象，患儿昏迷、甚至死亡。本研究中死亡15例（30%），进一步证实新生儿期发病的甲基丙二酸血症患者病情危重，如未能早期诊断、及时治疗，可引起严重后遗症或死亡。氨基酸代谢病是由于氨基酸代谢障碍所造成的一组疾病。在中国新生儿筛查疾病中苯丙酮尿症患病率最高，达1:100 00。本研究结果显示在新生儿期发病的氨基酸代谢病鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症最常见，占43.2%，主要表现为高血氨、昏迷，部分患者可有呼吸暂停甚至死亡（5例）；血串联质谱示瓜氨酸降低，但部分患儿瓜氨酸正常。尿气相质谱检测结果显示乳清酸和尿嘧啶升高。枫糖尿病在新生儿期也较常见，在本研究中占氨基酸代谢病的37.8%，多引起神经系统损伤，表现为嗜睡、昏迷、抽搐及肌张力增高，伴酸中毒。头颅MRI显示脑损伤，死亡6例。希特林蛋白缺乏症表现皮肤黄染和肝肿大，生化检查显示肝功能异常，总胆红素和直接胆红素增高，甲胎蛋白显著增高，经无乳糖奶粉治疗，5例患儿恢复正常。国外近几年利用串联质谱检测血酰基肉碱水平，用于脂肪酸氧化代谢病的新生儿筛查和临床高危患者的诊断，发现脂肪酸氧化代谢病的患病率较以往增高，在高加索人群中中链酰基辅酶脱氢酶缺乏症最多见[9]。本研究结果显示新生儿期发病的脂肪酸代谢病较氨基酸代谢病、有机酸血症少，且多为多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症，与高加索人种不同。脂肪酸氧化代谢病患儿临床表现无特异性，表现多样化，主要影响肝脏、心肌和肌肉。本研究确诊的患儿主要表现为反应差和肝肿大。常规实验室检查表现低血糖、酸中毒及肌酸肌酶显著增高。2例患儿猝死，可能与心脏受累有关。Dott等[12]对不明原因死亡的干血滤纸片进行串联质谱检测，诊断4例（0.5％）脂肪酸氧化代谢病，2例MCAD，2例VLCAD，提示猝死的病因之一为脂肪酸氧化代谢病。综上所述，本组患儿的临床和常规实验室检查结果显示，当新生儿期遇到原因不明的反应差、喂养困难、抽搐、意识障碍和肌张力异常等神经系统表现，或有呕吐、喂养困难和肝脾肿大等多脏器损害的症状体征，常规实验室检查有酸中毒、高血氨、高乳酸血症、低血糖、肝功能异常、贫血和酮症，或者头颅 CT、磁共振表现为不同形式的脑损害时，应考虑到有机酸、氨基酸和脂肪酸氧化代谢病的可能，及早留取血样或尿样进行血串联质谱、尿气相质谱特异性检测，达到早诊断、早治疗的目的，有利于降低新生儿期死亡率，减轻或避免不可逆的脏器损伤。[1]基金项目：上海市卫生局科研课题(2009210)；上海市科委重大课题（11dz1950300）作者单位：上海交通大学医学院附属新华医院，上海市儿科医学研究所， 200092通讯作者：韩连书，电子邮箱：xhhanlianshu@yahoo.com.cn

中华医学遗传学杂志，2007，24(6)：692-695韩连书 叶军 邱文娟 高晓岚 王瑜 张拥军 顾学范摘要 目的 本研究探讨利用串联质谱技术检测干血滤纸片中酰基肉碱水平，诊断脂肪酸氧化代谢病。方法 对象为2941例临床遗传性代谢病高危儿童,利用串联质谱技术检测患儿干血滤纸片中酰基肉碱水平，结合临床资料和常规生化结果，进行脂肪酸氧化代谢病诊断。结果 诊断14例脂肪酸氧化代谢病(0.5%)。其中肉碱棕榈酰转移酶I缺乏症1例，肉碱棕榈酰转移酶II缺乏症1例，短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1例，中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症7例，极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症2例，多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症2例。结论 通过串联质谱技术检测干血滤纸片中酰基肉碱水平，可对部分脂肪酸氧化代谢病的进行诊断。上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书[关键词] 串联质谱；脂肪酸氧化代谢病；酰基肉碱；遗传性代谢病Effective of tandem mass spectrometry on the diagnosis of fatty acid oxidation disorders HAN Lian-shu, YE Jun, QIU Wen-juan, GAO Xiao-lan, WANG Yu, ZHANG Yongjun, GU Xue-fan. (Department of Pediatric Endocrinology and Genetic Metabolism, Shanghai Institute for Pediatric Research, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medical, Shanghai 200092, China)Corresponding auther: GU Xue-fan, E-mail: guxuefan@citiz.net[Abstract] Objective The aim of the present study was to screen and diagnosis FAOD in high risk children with inborn error of metabolism using tandem mass spectrometry. Method The study group consisted of 2941 high risk cases of suspected inborn error of metabolism were tested. The acylcanitines in the dry blood filter papers of patients were tested by tandem mass spectrometry. The diagnosis of FAOD were according to the levels of the acylcanitines, the clinical symptoms, and other biochemistry study. Results Fourteen patients were diagnosed as FAOD. These patients included one carnitine palmitoyltransferase deficiency I, one carnitine palmitoyltransferase deficiency II, one short-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency, seven medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency, two very long-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency, and two multiple acyl-CoA dehydrogenase deficiency. Conclusion FAOD are not rare in China. Analiysis acylcarnitines levels tested by tandem mass spectrometry are helpful to diagnose FAOD.[Key words] tandem mass spectrometry; fatty acid oxidation disorders; acylcarnitine; inborn error of metabolism脂肪酸氧化代谢病是指脂肪酸进入线粒体途径或脂肪酸在b氧化过程中，由于所需酶的功能障碍导致脂肪酸氧化受阻所导致的一组疾病[1]。由于这些疾病缺乏特异的临床表现和常规实验室检查方法，诊断比较困难。近几年开展的串联质谱技术，一次实验可测定血中30余种酰基肉碱，可辅助10余种脂肪酸氧化代谢病的筛查和诊断[2]。我们于2002年11月在国内率先开展串联质谱新技术进行遗传性代谢病的筛查和诊断[3]，至今已筛查出14例脂肪酸氧化代谢病患儿，分析如下。1 对象与方法1.1 对象疑似遗传性代谢病患儿2941例，其中男1882例，女1059例，年龄中位数为1岁(1天～18岁)。临床表现包括智力、运动发育落后，反复呕吐、抽搐，生长发育迟缓、嗜睡或昏迷。体检发现肝脾肿大和肌张力异常等，常规实验室检查提示代谢性酸中毒、低血糖、高血氨、高乳酸血症、肌酸肌酶增高等。标本采集用干血滤纸片法。1.2 材料与方法1.2.1 试剂：酰基肉碱同位素内标混合试剂（含8种同位素内标）、甲醇、盐酸正丁醇、乙腈和氮气。1.2.2 方法：样品处理：参考文献[3]报道的方法，取直径3mm的干滤纸血片，经甲醇萃取，盐酸正丁醇衍生，进行串联质谱检测。1.3 脂肪酸氧化代谢病的诊断串联质谱检测的干血滤纸片中23种酰基肉碱水平正常上、下限值取1480例健康儿童的第99.8和0.002百分位，参考美国CDC报告的参考值及文献报道进行设定。不同的脂肪酸氧化代谢病的诊断，依据脂肪酸氧化代谢病的发病机制，以及国外有关串联质谱进行脂肪酸氧化代谢病诊断标准的报道[4]，分析分析串联质谱特异性酰基肉碱谱，结合临床表现和常规实验室检查，除外其他可能引起酰基肉碱异常的疾病进行确诊。2 结果2.1 串联质谱检测结果在2941例患儿中诊断脂肪酸氧化代谢病14例（0.5％），串联质谱检测结果见表1。肉碱棕榈酰转移酶I缺乏症（Carnitine Palmitoyltransferase Deficiency，CPT-I）主要表现为游离肉碱（Free carnitine，C0）及C0/乙酰肉碱（Actylcarnitine，C2）比值显著增高。CPT-II主要表现为肉豆蔻酰肉碱（Myristoylcarnitine，C14）、棕榈酰肉碱（Palmitoylcarnitine，C16）显著增高。短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(Short Chain Acyl CoA Dehydrogenase Deficiency，SCAD)以丁酰肉碱（Butylcartine，C4）增高为主。中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(Medium Chain Acyl CoA Dehydrogenase Deficiency, MCAD)以辛酰肉碱（Octanoylcarnitine，C8）增高为主。极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(Very Long Chain Acyl CoA Dehydrogenase Deficiency，VLCAD)除C14显著增高外，伴C14:1显著增高。多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(Multiple Acyl CoA Dehydrogenase Deficiency，MADD)表现为多种酰基肉碱增高。2.2 患儿串联质谱图不同疾病患儿的串联质谱图见图1。从图中可以看出，不同的脂肪酸氧化代谢病所对应的酰基肉碱的离子强度显著增高。CPT-I患者C0离子峰强度显著增高；CPT-II患者C14、C16和C18:1离子峰强度显著增高；SCAD患者C4和C3离子峰强度显著增高；MCAD患者C8、C6和C10:1离子峰强度显著增高；VLCAD患者C10、C12、C14、C14:1、C16和C16:1离子峰强度显著增高。2.3 临床资料分析14例患儿中男9例，女5例，年龄均值1.9岁（14天～14岁）。CPT-I患儿为1岁男孩，表现为智力运动发育落后。CPT-II患儿9个月男婴，表现为黄疸、肝脏肿大，肝功能异常。SCAD患儿为2岁3个月女婴，表现为猝死。MCAD患儿7例，全为男孩，临床表现差异较大。其中1例年龄14天，表现为反复低血糖，酸中毒，5天后死亡；1例年龄6个月，表现为运动发育落后，反应差，肝脏肿大；1例年龄1岁6个月，表现为反复呕吐、智力运动发育落后；1例年龄为4岁，表现为智力、语言发育落后；1例年龄为8岁，主要表现为矮小，身高仅103cm，运动发育正常，智力轻度落后；1例年龄为11岁，表现为注意涣散，学习困难；1例14岁,表现为进行性肌无力。2例VLCAD患儿均为女婴，年龄分别为4个月和8个月,表现为反复抽搐，智力落后，肌力低下，肝脏肿大，肌酸激酶显著增高。2例MADD患儿男、女各一例，均为15岁，表现为突发肌无力，进行性加重，以致瘫痪，语言及吞咽困难，1例患儿肌酸肌酶高达7000IU/L，并伴肌红蛋白尿。预后，14例患儿中已知6例死亡，占43％，其中 CPT-I 1例，SCAD 1例，MCAD 2例，VLCAD 2例，除1例猝死患儿年龄2岁个月，其余5例均小于1岁。3 讨论脂肪酸b氧化障碍可发生在脂肪酸进入线粒体及其氧化过程的各个环节，酰基肉碱是脂肪酸和有机酸代谢的中间产物，根据不同长度碳链的酰基肉碱水平的变化可对脂肪酸代谢病进行筛查和诊断[4]。国外近几年利用串联质谱检测血液中酰基肉碱水平，用于脂肪酸代谢病的新生儿筛查和临床高危患者的诊断，发现脂肪酸代谢病的患病率较以往增高，其中MCAD最多见[5，6]。基因突变研究显示其存在985A>G热点突变[7]。本研究检测到14例脂肪酸代谢病，其中7例MCAD，说明在我国脂肪酸氧化代谢病并不少见，与欧美国家相似，以MCAD多见。依据脂肪酸在线粒体内氧化代谢的机制，不同的肪酸代谢病表现为不同的酰基肉碱谱异常。CPT-I患儿除C0增高外，伴长链酰基肉碱的降低。Fingerhut[8]研究认为C0增高同时伴C0/(C16+C18)比值增高对诊断CPT-I更可靠，本研究诊断的CPT-I患儿C0/(C16+C18)比值为健康儿童的12倍，进一步支持本病的诊断。有报道CPT-II和VLCAD均可表现为C12、C14、14:1、C16、C16:1、C18和C18:1增高，CPT-II以C16增高显著，辅助(C16+C18:1)/C2比值作为诊断指标更敏感,VLCAD以C14、C14:1增高显著，辅助C14:1/C2或C14:1/C12比值作为诊断指标更敏感，结合比值可对这2种疾病进行区别[9*，10]。MADD患者由于多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏，导致体内多种酰基肉碱的畜积，串联质谱结果显示从短链到长链多种酰基肉碱增高。在某些遗传代谢病如瓜氨酸血症-II型、酪氨酸血症及半乳糖血症患者，可伴有长链酰基肉碱增高，但同时伴有氨基酸如瓜氨酸、甲硫氨酸或酪氨酸增高，故对于伴有氨基酸增高患儿应与氨基酸代谢病进行鉴别。。脂肪酸氧化代谢病患儿临床表现无特异性，尤其是MCAD患儿表现多样。主要影响肝脏、心肌和肌肉，部分患儿可影响脑和肾脏。本研究确诊的患儿主要表现为运动发育落后、肌无力和肝肿大。常规实验室检查表现低血糖、酸中毒及肌酸肌酶显著增高。2例患儿猝死，可能与心脏受累有关。Dott等[11]对不明原因死亡的干血滤纸片重新进行串联质谱检测，诊断4例（0.5％）脂肪酸氧化代谢病，2例MCAD，2例VLCAD，提示猝死的病因之一为脂肪酸氧化代谢病。对于本病的治疗尚缺乏特效的方法，主要是避免饥饿，给予肉碱、生玉米淀粉治疗，部分患儿经过治疗病情明显好转。本研究表明脂肪酸代谢病在我国并不少见，对于原因不明的肝肿大、肌无力、低血糖及运动、智力发育落后的患儿，应考虑到脂肪酸氧化代谢病的可能，及早检测酰基肉碱水平测定，以便诊断或排除脂肪酸氧化代谢病。致谢：本研究得到全国各地的相关医生同行的支持，在此深表感谢！

杨楠  韩连书  叶军  邱文娟  张惠文  龚珠文  张雅芬  王瑜  顾学范上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书酪氨酸血症I型(Tyrosinemia  type  1， OMIM 276700)属于常染色体隐性遗传病，是由于肝、肾组织中酪氨酸代谢的终末酶延胡索酰乙酰乙酸水解酶（Fumarylacetoacetase，FAH)缺陷，导致酪氨酸代障碍所致的一种遗传代谢病，又称肝肾型酪氨酸血症，本病患病率约为1/2 000至1/100 000[1]。多数患儿为急性型，起病于新生儿或婴儿期，以肝脏受累显著。少数为晚发型，患儿通常起病于1岁以后，以生长发育迟缓、进行性肝硬化、肾小管功能受损、低磷性佝偻病等为主要表现[1]。延胡索酰乙酰乙酸水解酶由FAH基因编码，FAH基因突变可引起延胡索酰乙酰乙酸水解酶活性降低或丧失。迄今为止有关FAH基因突变的报道已有40余种，我国酪氨酸血症I型的报道多为临床病例 [2-3]，基因突变的研究尚未见报道。本研究对3例酪氨酸血症I型患者进行FAH基因突变分析，现报道如下。1  对象和方法1.1 对象  确诊的酪氨酸血症I型患者患儿3例，男2例，女1例，年龄分别为2个月、 6个月及1岁。所有检查均获得患儿家长或监护人的知情同意。1.2 方法1.2.1  诊断：临床诊断主要依据（1）肝肿大，伴或不伴黄疸，甲胎蛋白显著增高；（2）串联质谱检测患儿血中酪氨酸(Tyrosine, Tyr)和酪氨酸与苯丙氨酸 (Phenylalanine, Phe)比值增高[2,4]；（3）串联质谱检测血或气相质谱检测尿琥珀酰丙酮升高[5]。1.2.2  PCR扩增及DNA测序分析：取患儿及父母外周静脉血，分离白细胞，提取DNA。根据参考文献[6]设计引物，覆盖FAH基因全部14个外显子。测序结果结合Genomes(NM_000137) 人类FAH基因序列来识别患儿中的突变。1.2.3  对未报道突变进行直接测序鉴定分析，并对比100例正常对照者测序结果以排除多态性。2   结果2.1  患儿临床资料及辅助检查结果例1于1月内起病，主要表现为肝肿大、阴囊反复水肿、贫血，肝脏CT未发现结节。例2于5月内起病，主要表现为肝肿大、脾脏增大、腹泻、喂养困难、运动发育落后，实验室检查：凝血时间：31.7s，部分凝血酶原时间：110.1s，腹部B超示肝肿大（肝硬化）。例3于1岁内起病，主要表现为肝肿大、腹胀，肝脏B超提示肝硬化伴结节。3例患者肝功能、血串联质谱结果和尿气相色谱-质谱结果见表1。例2和例3使用尼替西农联用低酪氨酸饮食治疗后，肝脏明显缩小，AFP下降。表1    3例酪氨酸血症-I型患者临床表现、临床检测结果和基因检测结果 患者检测指标（参考值）P1P2P3肝肿大肋下3.5cm肋下3cm肋下4cm肝硬化无有有，伴结节水肿有无无贫血有无无酪氨酸(20～100mmol/L)324.57295.72297.44苯丙氨酸(20～120mmol/L)106.2056.4760.93Tyr/Phe(0.5～2.0)3.005.204.97琥珀酰丙酮(1～5.0mmol/L)10.709.5013.40甲胎蛋白(0~25ng/mL)>35350>121000408谷丙转氨酶(10~42U/L)501537谷草转氨酶(0~75U/L)723344碱性磷酸酶(34~114U/L)202012501875尿琥珀酰丙酮SUAC(0)a165.620.00110.10尿4-羟基苯乙酸(8～75)a354.42173.80192.70尿4-羟基苯乳酸(0～7.0)a1504.81881.002245.90尿4-羟基苯丙酮酸(0～1.0)a1275.02469.90176.40基因检测结果突变1c.520C>T(R174X)c.455G>A(W152X)c.520C>T(R174X) 突变2c.1100 G>A(W367X)c.1027G>A(G343R)c.974_976delCGAinsGC注：a结果为尿气相质谱检测的离子强度分别与17烷酸离子强度的比值。2.2  FAH基因突变检测结果 3例患儿各检测到2个突变，共5种突变，其中P1患者检测到c.520C>T(R174X)及c.1100 G>A(W367X)突变（见图1），其母亲检测到c.520C>T(R174X)突变，其父检测到c.1100 G>A(W367X)突变；P2患者检测到c.455G>A(W152X)及c.1027 G>A(G343R) （见图2），其父亲检测到c.455G>A(W152X)，其母亲检测到c.1027 G>A(G343R)；P3患者检测到c.520C>T(R174X)及c.974-976delCGAinsGC突变（见图3），其父亲检测到c.520C>T(R174X)，其母亲检测到c.974_976delCGAinsGC突变。这些突变经反向测序得到同样结果。c.520C>T(R174X)及c.1027 G>A(G343R)为已报道突变，c.455G>A(W152X)、c.974_976delCGAinsGC及c.1100 G>A(W367X)为新突变。1a 1b1c 1d图1  P1患者FAH基因突变位点测序图注：1a:P1患者FAH基因c.520C>T突变；1b：FAH基因cDNA序列520位点正常对照；1c：P1患者FAH基因c.1100 G>A；1d：FAH基因cDNA序列1100位点正常对照 2a 2b2c 2d图2  P2患者FAH基因突变位点测序图注：2a：P2患者FAH基因c.455G>A突变；2b：FAH基因cDNA序列455位点正常对照；3c：P2患者FAH基因c.1027 G>A突变；3d：FAH基因cDNA序列1027位点正常对照3a 3b3c 3d图3  P3患者FAH基因突变位点测序图注： 3a: P3患者FAH基因c.520C>T突变；3b：FAH基因cDNA序列520位点正常对照；3c：P3患者FAH基因c.974-976delCGAinsGC；3d：FAH基因cDNA序列974-976位点正常对照2.3  基因型与临床表型的关系   根据发病年龄，临床将酪氨酸血症I型分为急性型(发病年龄<6个月)、亚急性型(发病年龄6个月～2岁)及慢性型(发病年龄>2岁)[7]。急性型患者主要表现为：出生后数日内出现严重的肝功能损害、黄疸等，少数重症病例死亡；亚急性型患者在婴幼儿期发病，出现、肝大、肝功能不全喂养困难等；慢性型患者发病较晚，多在幼儿期发病，多以肾病症状为主要表现。本研究中，患儿P1和P2属于急性型，主要临床表现为肝脾肿大、腹泻、水肿、贫血等，患儿P3属于亚急性型，表现为肝肿大。基因型与临床表型如表1所示。3 讨论酪氨酸血症I型以婴幼儿早期肝功能损害为主要临床表现，后期可出现生长发育迟缓和佝偻病的表现。未治疗的婴幼儿可表现为神经危象，急性型患者可死于肝功能衰竭。故早期诊断及治疗，对本病的预后起着至关重要的作用。由于此病缺乏特异性的临床表现，常规实验室检测如AFP显著增高、肝功能异常、血酪氨酸增高等，与其他引起肝脏损害和血酪氨酸增高的疾病如半乳糖血症、Citrin蛋白缺乏症等较难鉴别[8]。近10余年随着串联质谱和气相质谱的应用，血或尿琥珀酰丙酮水平增高作为诊断酪氨酸血症I型的关键指标已经逐步得到认可。本研究室利用串联质谱检测11例酪氨酸血症I型患儿血琥珀酰丙酮均升高，气相质谱检测的7例患儿的尿琥珀酰丙酮，仅4例增高[9] 。Peters等[10]研究也证实酪氨酸血症I型患者尿气相质谱检测琥珀酰丙酮可阴性，说明串联质谱联检测血琥珀酰丙酮作为诊断酪氨酸血症I型的指标更可靠。酪氨酸血症I型主要治疗方法是控制天然蛋白质摄入、给予不含苯丙氨酸、酪氨酸配方营养粉饮食治疗及尼替西农（nitisinone）药物治疗。天然蛋白质摄入量需控制在1～1.5g/Kg.d，不含苯丙氨酸、酪氨酸配方营养粉用量为1.5～2.0/Kg.d。尼替西农初始剂量为1mg/Kg.d，分2～3次口服。尼替西农是一种4-羟基苯丙酮酸二氧化酶抑制剂，可抑制酪氨酸转变为4-羟苯丙酮酸，对此病引起的肝脏、肾脏及心脏功能损害均有显著的效果[11,12]。本研究中3例患者，1例未进行治疗，目前生长发育迟滞；另外2例患者经过半年的配方营养粉及尼替西龙联合治疗，肝脏分别由3.5cm和4cm缩小至2cm和3cm，胆汁酸、碱性磷酸酶、g－谷氨酰转肽酶及甲胎蛋白均显著下降，血和尿琥珀酰丙酮降至正常，血酪氨酸水平轻度下降[13]。酪氨酸血症I型是由于编码延胡索酰乙酰乙酸水解酶的FAH基因突变所致，至今有关FAH基因突变已经报道40余种，不同的种族存在不同的热点突变。Elpeleg等[14]报道以色列Ashkenazi Jewish族患者3例均为P261L突变，Moslem-Palestinian族患者10例中8例为IVS8 –1G>C/IVS8 –1G>C突变。Poudrier等[15]报道法裔加拿大人群中，87.9%患者携带c.1062+5G>A突变，魁北克新生儿筛查发现此突变携带率高达1：66。Faiqa等[16]报道中东地区43例患者携带17种突变，其中R237X为热点突变。韩国有1例大片段缺失(外显12-14)的报道[17]。中国尚无此病的基因突变报道。本研究中在3例患者中发现5种突变，分别为：W152X、R174X、G343R、W367X和c.974_976delCGAinsGC。患儿P1基因型为c.520C>T/c.1100 G>A， 即携带R174X和W367X两个无义突变，R174X于1996年报道[18]，发现1例波兰患者携带该突变，临床表型不详。R174X和W367X均为无义突变，其编码产物为截短蛋白，产物在体内降解而严重影响酶活性。本研究中，患儿P1于1月龄内发病，为急性型，主要表现为肝肿大、水肿、贫血。患儿P2基因型为c.455G>A/c.1027 G>A，即携带W152X和G343R突变，其中G343R于2011年报道[16]，见于3例中东地区患者。G343位点位于高度保守区，在酶活化位点附近，该位点G343R突变可显著影响酶活性[19]。W152X为无义突变，其编码产物为截短蛋白，产物在体内降解而严重影响酶活性。患儿P2于5月龄内发病，为急性型，主要表现为肝肿大、肝硬化、腹泻、出血。患儿P3基因型为c.520C>T/ c.974_976delCGAinsGC，即携带R174X 和c.974_976delCGAinsGC突变。c.974_976delCGAinsGC引起读码框移，在其下游49个密码子出现终止密码子，导致翻译提前终止，突变产物比正常蛋白少47个氨基酸，可影响酶活性。患儿P3于1岁内发病，为亚急性型，主要表现为肝肿大、肝硬化。由于本研究病例数较少，尚不能明确基因型与临床表型的关系。在Rootwelt报道基因型为IVS6-1G>T/IVS6-1G>T的8例患者，5例表现为亚急性型，3例为慢性型[20]；而在北欧和地中海国家报道的病例中，相同的基因型IVS6-1G>T/IVS6-1G>T患者8例，6例表现为急性型，2例表现为慢性型[21]；在Bergman报道的西班牙病例中，13例患者基因型为IVS6-1G>T/IVS6-1G>T，11例表现为急性型，1例表现为亚急性型，1例表现为慢性型[19]。由此可见，尽管患者有着相同的基因型，但是临床表现并不尽相同，还有其他因素可以影响临床表现。类似的情况再其他遗传性代谢病中也有发现，如苯丙酮尿症[22]。对基因型IVS6-1G>T/IVS6-1G>T的患者长期随访发现，患者出现肾钙沉着症的比例显著低于其他基因型的患者，但是出现肝肿大的比例与其他基因型患者相同[23]。由于本研究病例数较少，尚不能明确基因型与临床表型的关系，基因检测可为患者家庭提供产前诊断，并为进一步的相关研究提供依据。本科室已经开展多种罕见病的基因产前诊断[24,25]。[1]基金项目：国家高新技术研究发展计划(863计划)（2007AA02Z447）；上海市卫生局重大课题（2008ZD001）；上海市卫生局科研课题(2009210); 上海市科委重大课题（11dz1950300）作者单位：200092 上海交通大学医学院附属新华医院,上海市儿科医学研究所,内分泌、遗传代谢病研究室

黄倬（综述）韩连书（审校）[关键词] 原发性肉碱缺乏症；发病机制；基因突变Keywords: Primary carnitine deficiency；Pathogenesis；Gene mutation原发性肉碱缺乏症（primary carnitine deficiency，PCD，OMIM212140）是肉碱转运体OCTN2功能缺陷所致的脂肪酸氧化代谢病，属于常染色体隐性遗传病。肉碱缺乏导致长链脂肪酸不能进入线粒体参与β氧化，使乙酰CoA生成减少，当机体需要脂肪动员供能时，组织不能得到足够能量，且细胞内脂质蓄积，继而出现一系列生化异常及脏器损害，如低酮型低血糖、扩张型心肌病、肝肿大、肌无力等。PCD于1975年被首次报道，13年后有研究提出PCD是由于细胞膜肉碱转运障碍所致，1998年PCD的基因被定位，此后，PCD的报道日益增多。随着串联质谱技术的应用，新生儿筛查和临床高危的诊断率显著提高[1，2]；左旋肉碱替代治疗的介入，使越来越多PCD患者的预后得到了改善。同时，PCD发病机制和基因突变的研究也在不断地深入。上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书1 发病机制自然界中的肉碱（即3-羟-4-三甲胺基丁酸）具有左旋和右旋两种形式，其中左旋肉碱具有生理活性。人体内的肉碱约75%来自食物，25%由肝脏和肾脏合成，正常情况下，左旋肉碱通过细胞膜上的高亲和力转运体OCTN2的作用进入细胞内（肝细胞除外），在心肌和骨骼肌含量最高。体内脂肪酸的b氧化代谢是在线粒体中进行的，细胞内的长链脂肪酸不能直接进入线粒体，其活化形式长链脂酰CoA在线粒体外膜的肉碱棕榈酰基转移酶Ⅰ的催化下与肉碱结合生成脂酰肉碱，后者在线粒体内膜的肉碱脂酰肉碱转位酶的作用下进入线粒体基质，随后在线粒体内膜内侧的肉碱棕榈酰基转移酶Ⅱ的作用下分解为长链脂酰CoA及游离肉碱，长链脂酰CoA进一步参与β氧化，释出的肉碱则在肉碱脂酰肉碱转位酶的作用下被转运出，循环再利用，如图1所示。中、短链脂肪酸可直接进入线粒体。另外，肉碱可降低乙酰CoA/CoA比例，提高丙酮酸脱氢酶复合体的活性，促进葡萄糖的氧化利用；还能提高线粒体呼吸链酶复合体的活性，加速ATP的产生[3]。此外，肉碱还具有调节免疫应答、抗氧化、抑制细胞凋亡、维持线粒体超微结构及膜稳定等生理作用。OCTN2是Na+依赖性有机阳离子/肉碱转运体，由557个氨基酸组成，包含12个跨膜区，存在于心肌、骨骼肌、小肠、肾小管、皮肤成纤维细胞及胎盘等组织细胞膜上。有学者对其功能域进行研究发现[4，5]：跨膜区在肉碱的识别和转运中起关键性作用；N-末端（氨基酸序列1-193）可能存在Na+的结合位点；C-末端（氨基酸序列342-557）与Na+-肉碱复合物的转运有关，其中位于跨膜区10与跨膜区11之间细胞内环路是偶联Na+电化学梯度和Na+-肉碱复合物穿过细胞膜的重要场所，该环路中的酪氨酸残基起重要作用。其相关基因突变导致OCTN2转运肉碱的功能缺陷，肉碱不能进入到细胞内，通过肠道吸收的肉碱减少，体液中游离肉碱相应减少。同时肾小管肉碱重吸收障碍致尿液肉碱排泄增加、血浆肉碱水平降低，细胞内肉碱更加缺乏，导致长链脂肪酸不能进入线粒体进行β氧化，乙酰CoA生成减少，致使机体在需要脂肪动员供能的情况下能量供应不足，而脂质等在细胞内大量蓄积；另外，肉碱缺乏还间接影响葡萄糖等代谢途径。最终引起机体损伤，尤其在禁食或应激时，损害更甚。1.1 心脏损伤机制患儿常见的心肌损害有心室扩大、心肌肥厚、心功能下降甚至衰竭、心律失常等。其发病机制主要与能量缺乏和脂肪酸等的毒性作用有关。正常心肌能量供应的60%～90%来自脂肪代谢[6]，肉碱缺乏导致细胞能量不足，引起心肌收缩力降低，促进心肌重构，而脂肪酸的堆积加速了心肌不可逆的损伤过程。且游离脂肪酸可改变心肌细胞电活动导致心律失常[7]。心肌脂肪酸代谢障碍导致主要能量来源由脂肪酸向葡萄糖转变[6]，尤其在心肌细胞缺血缺氧时，能量代谢以无氧酵解为主，心肌细胞内ATP和磷酸肌酸生成更少，H+增多，加重心肌细胞结构和功能损害。Allard等明确指出，肉碱缺乏是扩张型心肌病发病的根本原因之一[8]。1.2 骨骼肌损伤机制骨骼肌受累的患儿常表现为肌无力、肌张力减退、运动不耐受或肌痛等，血中肌肉型肌酸激酶升高，肌肉活检显示肌纤维内大量脂滴沉积, 主要见于Ⅰ型纤维，而Ⅱ型纤维多出现萎缩[9]。其损害机制同样涉及供能不足及脂质沉积。对于持续时间较长的低到中等强度的运动，长链脂肪酸是能量的主要来源[10]。骨骼肌细胞内肉碱缺乏导致线粒体脂肪酸氧化障碍，不能提供机体运动所需的能量，导致运动强度和耐力下降，抗疲劳能力减退。而肌痛可能与脂肪酸及代谢中间产物蓄积有关。Ohkuma等通过病理学分析从形态学角度揭示了脂质沉积对肌纤维及线粒体的损害作用[11]：肌纤维间大量脂肪颗粒充填，密集区相应的肌纤维呈破碎样改变；线粒体数目增加但结构松散、嵴不清晰，脂滴紧靠线粒体排列，使其受压变形。1.3 肝脏损伤机制肝脏不同于其他组织，肝细胞具有单独的低亲和力的肉碱转运体[7]，故损伤较心脏及骨骼肌少见。患儿主要表现为肝肿大、肝酶升高。其机制与肝脏脂肪变性有关。当血浆肉碱极度缺乏，影响到被动扩散进入肝细胞的肉碱量时，肝脏脂肪酸代谢障碍，蓄积的游离脂肪酸在内质网中合成的甘油三酯增多，血脂升高的同时，肝细胞发生脂肪变性，这在早期的动物实验中已得到证实[12]。研究进一步发现，肝内过多的脂肪酸的毒性作用直接介导肝脏损害的进展，诱导肝细胞凋亡，下调其增殖能力，并增加对内毒素的易感性[13]。此外，肝脏受损使其合成肉碱的能力减退，进一步造成机体肉碱缺乏，而肝细胞再生所需能量供应不足，导致损伤更加恶化。另外，肝脏受损使酮体生成及糖异生减少，长期饥饿或糖供应不足时，葡萄糖耗尽后不能得到内源性补充，导致严重的低血糖，大脑缺乏葡萄糖及酮体的能量供应，使功能受损，出现意识障碍。1.4 其他损伤机制部分患儿有腹痛、腹泻、胃食管反流等消化道症状，机制可能与胃肠道粘膜脂质沉积有关，且胃肠道高度依赖脂肪酸β-氧化供能。幼年内脏脂肪变性老鼠模型揭示肉碱对于维持肠道的正常结构和形态必不可少，此外，OCTN2基因启动子区域的突变有导致克罗恩病的倾向，但肉碱转运缺陷与克罗恩病发病机制的相关性有待进一步研究[14]。高氨血症可能由于脂酰CoA蓄积造成尿素循环的酶表达受到抑制所致[15]。部分PCD患者贫血，可能因为肉碱参与红细胞的代谢，有稳定红细胞膜、增加渗透阻力的作用[16]。2 基因突变2.1 基因突变的特点肉碱转运体OCTN2的编码基因为SLC22A5，定位于常染色体5q31，由10个外显子组成。已报道的突变位点涉及外显子1-9及内含子3、7和8。有研究发现突变最频繁的编码区为外显子1 [17]。大多数突变影响OCTN2的跨膜区及细胞内环路[18，19]。目前已发现80余种突变类型，多为错义突变，无义突变及移码突变次之，剪接位点突变最少见。大多数家族具有独特的突变类型，但也有无血缘关系的患者或杂合子携带相同突变的报道，如N32S突变已分别在法罗群岛、日本以及其他地区的患儿中发现[20]。突变谱在不同种族人群中存在差异，R282X常见于高加索人群，R169W在意大利患者中多见，Y211C在西非人群中多次被观察到；S467C和W132X在日本秋田市人群中频发，检出率分别为4/9和3/9；我国台湾地区人群中R254X最常见，约占临床病例中总等位基因突变的50%[21]。通过共轭显微镜研究发现，SLC22A5错义突变导致OCTN2缺陷有如下三种情况[19]：（1）使转运体不能在细胞膜上成熟定植，几乎全部滞留在高尔基体或内质网内，如R83L；（2）导致大部分在细胞质中滞留，分布较为扩散，少数可到达细胞膜，如G242V；（3）不影响转运体在细胞膜上的定植，但使其功能区不同程度受损，如R169W。2.2 纯合子的临床表型PCD纯合子患者通常具有以下特点：OCTN2转运肉碱的能力严重损坏或完全破坏，尿液肉碱排泄量增多，血浆及组织细胞内肉碱水平极低。患者可表现出不同程度的临床症状和体征，但也有部分患者被诊断时未出现任何相关症状且心功能评估正常[22，23]。PCD患者无明显性别差异，可于任何年龄发病，临床表型及首发症状各异，病情轻重及进展速度不一；也有患者终身不发病但存在急性发作及猝死的风险。部分患者于2岁以前发病，多表现为禁食诱发的低酮型低血糖急性发作，严重者出现昏迷或死亡。患者中常见的心肌病及骨骼肌病，通常发病较为隐匿，出现显著症状和体征较迟。目前PCD基因型与临床表型的关系尚未明确。有研究发现，有些突变的OCTN2残存少量转运活性，如S467C约保留11%的转运活性，其复合杂合突变的患者没有临床症状，仅个别患者经检查发现扩张型心肌病；有些突变的OCTN2其转运活性几乎不可测得，如R254X，携带该突变的患者临床表现典型，多以心肌病为主[21]。Rose等指出，在无症状患者中，至今未发现同时携带两个无效等位基因的患者，可能解释无症状患者的肉碱转运活性均值高于有症状患者；同时指出，P46S主要见于无症状患者基因中。Filippo等有类似发现[18，24]。另一些学者认为基因型与临床表型相关性很难确立。许多研究显示，相同的突变可致不同的临床表型。Spiekerkoetter等报道的1个土耳其家系，父亲和2个儿子均为R471H的纯合子（该突变的OCTN2肉碱转运活性为正常对照组的1.5%），然而仅其中1个儿子在婴儿期出现严重症状，表现为Reye综合征样发作，其28岁的父亲和5岁的哥哥均无症状[25]。Lund等报道的病例中，无血缘关系的2例N32S纯合突变患者（该突变的OCTN2肉碱转运活性无法测得），1例于4月时发病，表现为低血糖、肝肿大、肌张力减退；1例19岁时因阳性家族史被筛查出，仅诉易疲劳[20]。另外，文献中许多不同的突变可呈现相似的临床表型。如R254X、V295X、Y211C等纯合突变的PCD患者大多以心肌病为主要临床表型；F17L/R471C复合杂合突变与G234R/R254X复合杂合突变的患者首发症状相同，均表现为高血氨、低血糖、Reye综合征样发作；R254X/S467C复合杂合突变与N32S纯合突变的患者仅有体力下降的表现[20-22，26]。因此认为，不能通过基因型预测PCD患者的临床表型，也不能通过表型推测其基因型。2.3 杂合子的临床表型PCD杂合子血浆及组织细胞内肉碱浓度低于正常对照组均值，其尿液肉碱排泄量约正常的2～3倍，成纤维细胞肉碱吸收率为正常对照组的一半或以下，但通常无临床表现，可能与肉碱水平尚能满足机体正常代谢所需有关[7]。有学者认为，PCD杂合子在禁食、长时间运动、疾病等状态下，可能出现症状[27]。目前关于PCD杂合子的研究甚少，持续低水平的肉碱浓度对其造成的影响（表型特点、生化参数、临床过程等）还不十分明确。Sarafoglou等报道2例老年PCD杂合子存在心功能异常[27]。日本学者通过超声心动图检查，发现PCD杂合子随年龄增加，易患迟发型心肌肥厚，但心功能正常。PCD动物模型的相关研究显示：与正常小鼠相比，杂合子老鼠的左室肌细胞直径随年龄增长而增加；当压力负荷过重时，血浆及心肌内肉碱浓度处于相对低水平的杂合子老鼠，其病理性心肌肥厚和心功能衰竭的易患性增加[28]。还有动物实验发现，PCD杂合子小鼠血浆、肝脏、心肌及骨骼肌内的甘油三脂含量多于正常对照组。另外，有PCD杂合子新生儿出现呕吐、食欲下降等胃肠道症状的报道。因此， PCD杂合子可能出现某种程度的心功能不全、肠功能紊乱或血脂异常。

黄倬 韩连书 叶军 邱文娟 张惠文 高晓岚 王瑜 季文君 李晓燕 顾学范甲基丙二酸血症（methylmalonic acidemia）是由于甲基丙二酰CoA变位酶或其辅酶腺苷钴胺素缺陷，导致甲基丙二酰CoA生成琥珀酰CoA途径障碍，目前已发现7种亚型。其中cblC、cblD和cblF亚型除导致腺苷钴胺素缺乏引起甲基丙二酸血症外，还伴有蛋氨酸合成酶的辅酶甲基钴胺素合成减少，导致血同型半胱氨酸增高，因而表现为甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸尿症。患者表现神经系统、眼、血管、皮肤及血液系统等多个脏器和系统损害。甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸尿症自1969年被首次报道以来，治疗方案逐渐完善，目前通过维生素B12、甜菜碱、叶酸、维生素B6及左旋肉碱综合治疗，患者死亡率下降，生活质量提高，但远期预后仍不容乐观[1-3]。近年来国内外关于该病治疗及预后的文献多为个案报道，大样本量观察较少。现总结上海新华医院小儿内分泌遗传代谢病研究室2004年9月至2012年4月治疗并随访的58例甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸尿症患者的门诊随访资料，分析其治疗后的病情转归和预后。上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书对象与方法一、对象58例甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸尿症患者来自中国16个省市，男34例，女24例。其中50例为临床患者，首诊年龄18 d～30.8岁，根据发病年龄≤1岁定义为早发型、＞1岁为迟发型[1]。早发型42例，发病年龄中位数为1个月（生后1 d～7个月），迟发型8例，发病年龄中位数为8.8岁（1.6～30岁）。另外8例为新生儿筛查发现，3例在治疗前出现临床症状。发病患者（53例）的临床表现包括：喂养困难37例，嗜睡32例，抽搐28例，反复呕吐26例，发育迟缓或倒退24例，皮肤损害11例，肌力低、肌张力异常37例，小头畸形25例等。常规实验室检查异常主要有：贫血28例（其中13例为大细胞性贫血），代谢性酸中毒14例，高血氨21例，乳酸增高18例。共有32例患者行头颅MRI检查，28例显示有脑损害改变。8例行脑电图检查均提示异常。二、方法1. 诊断方法：诊断方法参考文献[4]及[5]，归纳为：（1）临床表现及一般生化异常，如反复呕吐、嗜睡、抽搐、发育落后或倒退、贫血及代谢性酸中毒等；（2）串联质谱检测血丙酰肉碱（Propionylcarnitine，C3）大于4μmol/L、丙酰肉碱与乙酰肉碱（Acetylcarnitine，C2）比值（C3/C2）大于0.25；（3）气相色谱质谱检测尿甲基丙二酸大于3.6和/或甲基枸橼酸水平大于1.1（尿结果检测值为与内标17烷酸的比值）；（4）血同型半胱氨酸水平大于14μmol/L；（5）排除维生素B12、叶酸缺乏。来自新生儿筛查患者可无临床表现。部分患者通过基因突变检测确诊。2. 治疗方法：急性期给予补液、纠酸；高热量低蛋白饮食，天然蛋白质摄入量控制在0.8～1.2 g/(kg·d)，同时给予不含异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸和蛋氨酸的特殊奶粉或蛋白粉治疗，对于蛋氨酸缺乏患者补充蛋氨酸（200 mg/d）；左旋肉碱100～200 mg/(kg·d)静滴或口服；维生素B12，1 mg/次，每日1次，肌内注射，通常连续5 d。稳定期治疗包括肌肉或皮下注射维生素B12（氰钴胺或羟钴胺，1mg/次，每周1～2次），口服甜菜碱（0.5～3 g/d，年长患者剂量可达6～9 g/d）、左旋肉碱[50～100 mg/(kg·d)]、叶酸（10～30 mg/d）及维生素B6（10～30 mg/d），必要时给予蛋氨酸（200 mg/d）；通常不需要限制饮食，部分病情反复患者减少天然蛋白质摄入[1～1.5 g/(kg·d)]，同时给予特殊奶粉或蛋白粉[1～3 g/(kg·d)]以保证营养。7例患儿家长在患儿稳定期自行将维生素B12改为口服（3～6 mg/d），其余治疗未变。本研究室于2010年9月开始采用羟钴胺治疗，故部分患者先后接受氰钴胺和羟钴胺肌注或皮下注射治疗。3. 随访方法：治疗初期每1～3个月随访1次，病情稳定后半年～1年随访1次。随访方案：了解病情变化、体格发育及运动语言发育进展；检测血常规、血气、血氨及乳酸等常规实验室检查项目；动态监测血串联质谱、尿气相色谱质谱及血同型半胱氨酸水平；以及进行头颅MRI、脑电图等辅助检查。其中血串联质谱和尿气相色谱质谱为每次随诊必查项目。4. 统计学方法：采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。由于检测值多为非正态分布，用中位数（最小值～最大值）表示。结果比较均采用“配对设计资料的符号秩和检验”，以P＜0.05为差异有统计学意义。结 果一、58例患者均为维生素B12有效型，其中3例早发型患儿分别于治疗随访3周、5个月及1个月后死于多器官衰竭，死亡时年龄分别为5个月、11个月和1岁。其余存活的早发型患儿，治疗随访最短1个月，最长7年1个月；8例迟发型患者，治疗随访最短40 d，最长3年1个月；8例新生儿筛查患儿，治疗随访最短1个月，最长3年3个月。患者临床表现变化53例出现临床症状的患者经急性期治疗后，精神好转，呕吐抽搐停止，胃纳改善。幸存的发病患者在稳定期治疗后，皮损消失，体格发育多数可达正常同龄儿水平，8例在上感、肺炎、发热等应激状态下再次抽搐，肌力肌张力改善较慢、6例仍有肌力低表现，小头畸形仅2例头围恢复正常。存活的39例早发型患者中，37例有不同程度运动语言发育迟缓，其中末次随访年龄＞1岁者23例，15例1岁6个月～4岁时会独走，但目前仅12例会讲话，13例进行神经心理发育评估，发育商或总IQ＜50分；5例出现眼部并发症，包括眼斜视3例，眼不追视2例。8例迟发型患者遗有不同程度智力低下、认知障碍或步态异常。8例新生儿筛查患者中，4例持续无症状，无明显发育落后；4例出现发育迟缓，其中2例行Bayley量表测试提示发育指数＜（50～60）分；1例出现眼斜视。二、患者辅助检查结果变化55例存活患者中，酸中毒者经积极补液纠正代谢性酸中毒后，pH、HCO3-及BE均正常；25例贫血患者血红蛋白从23～108 g/L升高至106～152 g/L（正常参考范围110～160 g/L），2例仍有轻度贫血，其中大细胞性贫血者红细胞体积从96.5～111.5 fl回复至82～87.8 fl（正常参考范围82～95 fl）；仍有2例高血氨，2例乳酸增高。7例复查头颅MRI，1例稍有改善，3例无明显变化，3例有进一步脑损害改变。2例复查脑电图提示异常程度减轻。三、患者血串联质谱、同型半胱氨酸及尿气相色谱质谱结果变化患者治疗前后血C3水平、C3/C2比值变化见表1。治疗后患者血C3水平和C3/C2比值明显降低，差异有统计学意义，其中38例C3水平降至正常，51例C3/C2比值降至正常。5例患者治疗前由于血游离肉碱水平降低，导致血C3水平正常，但C3/C2比值增高，结合尿气相色谱质谱结果甲基丙二酸增高确诊。患者治疗前后血同型半胱氨酸水平变化见表1。治疗前患者血同型半胱氨酸水平均显著高于正常参考值，治疗后降低，与治疗前比较差异有统计学意义，但仍高于正常参考值。治疗前25例患者血蛋氨酸水平[（5.22±1.22）μmol/L]低于参考值[（8～35）μmol/L]，治疗后恢复正常。患者治疗前后尿甲基丙二酸和甲基枸橼酸水平变化见表1。治疗前患者尿中甲基丙二酸水平均高于正常上限值，甲基枸橼酸水平增高或正常。治疗后患者尿甲基丙二酸和甲基枸橼酸水平较治疗前降低，差异有统计学意义，其中17例尿甲基丙二酸水平降至正常，50例尿甲基枸橼酸水平降至正常。表1 患者治疗前后血C3、C3/C2、同型半胱氨酸和尿甲基丙二酸、甲基枸橼酸（与内标17烷酸的比值）的结果变化[中位数(最小值～最大值)]组别例数血串联质谱检测血同型半胱氨酸（μmol/L）尿气相色谱质谱C3（μmol/L）C3/C2甲基丙二酸甲基枸橼酸（正常值 0.5～4）（正常值＜0.25）（正常值 6～14）（正常值 0.2～3.6）（正常值 0～1.1）治疗前587.730.7497.30168.553.02(1.50～18.61)(0.29～2.06)（25.10～250.00）(6.73～1032.82)(0.00～17.17)治疗后582.740.1643.806.810.35(0.47～12.09)（0.03～0.62）(17.00～97.80)(0.00～95.43)(0.00～4.64)Z值6.3456.6245.2466.6246.471P值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01注： C3：丙酰肉碱；C3/C2：丙酰肉碱/乙酰肉碱四、维生素B12口服与肌注治疗效果比较7例患儿家长在患儿稳定期自行将维生素B12改为口服（3～6 mg/d），其余治疗未变，1至3个月后检测患儿尿甲基丙二酸水平较肌注或皮下注射时增高（由7.97～142.31升至26.51～325.53），差异有统计学意义（Z=2.366，P=0.018）。五、氰钴胺和羟钴胺治疗效果比较共有17例先后采用氰钴胺和羟钴胺治疗，血C3水平、C3/C2比值及尿甲基丙二酸水平变化见表2。与氰钴胺相比，换用羟钴胺治疗后患者血C3水平、C3/C2比值及尿甲基丙二酸水平降低。表2 17例患者分别采用氰钴胺和羟钴胺治疗后血C3、C3/C2及尿甲基丙二酸（与内标17烷酸的比值）的结果变化[中位数(最小值～最大值)]治疗用药例数C3（μmol/L）C3/C2甲基丙二酸（正常值 0.5～4）（正常值＜0.25）（正常值 0.2～3.6）氰钴胺178.180.3953.32(2.12～11.74)(0.14～1.14)(6.92～437.36)羟钴胺173.690.2323.47(1.35～7.21)（0.11～0.48）(5.96～65.08)Z值3.3383.2452.817P值0.0010.0010.005注：C3：丙酰肉碱；C3/C2：丙酰肉碱/乙酰肉碱。讨 论甲基丙二酸血症是有机酸血症的常见病种，张尧等[6]报道甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸尿症是中国人甲基丙二酸血症的常见类型。由于甲基丙二酸及其相关代谢物（如甲基枸橼酸、丙二酸和丙酰CoA）的神经毒性和肾毒性[7-8]以及同型半胱氨酸蓄积导致的血管损害和神经损害[9-10]，若无及时有效的治疗，疾病将持续进展，患者预后凶险。甲基丙二酸血症的治疗原则是减少代谢毒物的生成及加速其清除[11]。目前甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸尿症的治疗以药物治疗为主[5,10]：①维生素B12：使突变的酶蛋白活性最大化，有助于增加辅酶的合成；②甜菜碱：作为甲基供体，激活同型半胱氨酸重甲基化的旁路途径；③叶酸：作为甲基供体，增强蛋氨酸合成酶催化的同型半胱氨酸重甲基化途径；④维生素B6：提供同型半胱氨酸转硫化的辅酶；⑤左旋肉碱：预防肉碱缺乏，并促进有毒代谢物的排泄。多数学者认为，维生素B12的给药类型羟钴胺优于氰钴胺，给药途径肌肉或皮下注射优于口服[12-13]，本研究也支持这一观点，患者经羟钴胺肌肉或皮下注射治疗后，异常代谢指标降低更为显著，且代谢控制更为稳定。关于是否限制天然蛋白摄入尚未达成共识，因患者自身蛋氨酸合成障碍，特殊饮食治疗可能进一步加重蛋氨酸缺乏，因而，对于病情稳定的患者，我们鼓励天然饮食；而对于急性发病期或病情反复的患者，适当的饮食控制，有助于甲基丙二酸水平的降低和病情的恢复[14]。与既往报道的治疗效果相似[3,6,15]，本研究患者临床表现如呕吐、抽搐、嗜睡、体格发育落后、皮损、肌力低、肌张力异常及精神症状均有明显改善，但已造成的神经损害如小头畸形、智力落后、运动障碍等较难恢复，生化异常如代谢性酸中毒、贫血、蛋氨酸缺乏等可被纠正，异常代谢物水平均显著下降，但尿甲基丙二酸及血同型半胱氨酸水平较难降至正常。根据Yang等[1]和Rosenblatt等[2]的观察，早发型较迟发型死亡风险高，本研究3例死亡患者均为早发型，虽然治疗后临床症状一度好转，血C3/C2比值及尿甲基丙二酸水平均有显著降低，但由于病情反复、进行性加重，最终死于多器官衰竭。张尧等[4][6]报道的迟发型病例中30%完全康复，而国外学者总结的迟发型病例中痊愈者较少见[15-17]，本研究迟发型患者尚无完全康复者，可能由于随访时间尚短或治疗前已发生不可逆损害。随着新生儿筛查的普及，越来越多患者得到早期诊断和治疗，本研究新生儿筛查确诊患者新生儿期即开始治疗，目前无死亡病例，代谢控制较稳定，其中50%未发病，提示早期诊治，尤其在症状出现前开始治疗，有助于降低该病的发病率及死亡率，与Dionisi-Vici等[18]报道一致。另外，本研究中，有8例患者感染等应激状态下再次抽搐，提示感染等因素可能导致病情反复，根据经验，及时给予葡萄糖溶液输注以防止分解代谢，增加维生素B12的治疗频率（如每天1次），以及其他对症支持治疗，患者可能避免急性发作及猝死。如前所述，治疗后患者临床表现及生化异常明显改善，但已造成的神经损害较难逆转，是影响远期预后的主要因素。文献报道中多见神经发育迟缓、脊髓病变等神经系统并发症[19-20]。本研究中，49例患者有不同程度运动语言及智力落后。6例患者无明显发育落后，可能由于诊治及时，治疗前尚未发生不可逆神经损害。但有学者指出，多数患者在胎儿发育期已受到损伤，除有毒代谢物的神经毒性作用，蛋氨酸合成缺陷导致细胞内s-腺苷蛋氨酸/s-腺苷同型半胱氨酸比值降低，继而干扰胎儿器官发育期的DNA和组氨酸甲基化[20]，导致构成大脑结构完整性的重要物质合成障碍[9]。视力损害是该病另一个常见的后遗症。研究者们发现，尽管早期治疗，许多患者仍出现斜视、眼球震颤、黄斑病变、视网膜病等，甚至失明，主要见于早发型患者[20-23]。本研究中，6例患者出现眼部并发症表现（斜视和眼不追视），5例为早发型，1例为新生儿筛查确诊患者，尚无迟发型患者有类似表现。另外，Gerth等[23]发现在早发型患者中视损害与年龄增长呈正相关，因而随着随访时间的延长，视损害的发生率是否增加值得进一步观察。由于单纯型甲基丙二酸血症和单纯型同型半胱氨酸尿症患者中视损害罕见[24]，故其发病机制有待进一步阐明，以期指导治疗改善预后。综上所述，维生素B12、甜菜碱、叶酸、维生素B6及左旋肉碱联合治疗可有效改善患者急性期临床表现及血尿生化异常。其中，维生素B12类型优选羟钴胺，给药途径优选肌肉或皮下注射。早期诊治有助于减少该病的发病率和死亡率，迟发型及未发病患者的治疗效果优于早发型患者。

【摘要】 目的 探讨原发性肉碱缺乏症的诊断与治疗。。方法  利用串联质谱技术对27万例新生儿和1.2万例临床遗传代谢病疑似患儿进行游离肉碱及酰基肉碱检测，对游离肉碱降低的患儿进行肉碱转运蛋白基因突变检测确诊。对确诊患儿给予左旋肉碱治疗，100~300 mg/（kg·d），分3次静滴或口服。随访时间3个月~3年。结果  共确诊17例原发性肉碱缺乏症患儿，其中6例来自新生儿筛查，11例来自临床患儿。17例患儿均检测到基因突变。患儿血游离肉碱水平[（2.85±1.87）mmol/L]低于参考值（10 mmol/L），伴不同种类的酰基肉碱水平下降。治疗随访14例，给予左旋肉碱治疗1~3个月后，临床症状消失，血游离肉碱升至正常，由(2.91±2.01)mmol/L升至(20.63±8.32)mmol/L，其他酰基肉碱也升至正常。结论 采用串联质谱技术检测血游离肉碱、酰基肉碱水平及肉碱转运蛋白基因检测诊断了17例原发性肉碱缺乏症患儿，其中14例患儿经大剂量左旋肉碱治疗获得了较好的疗效。上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书【关键词】  原发性肉碱缺乏；肉碱；串联质谱；治疗17 Patients with Primary Carnitine Deficiency: Diagnosis, Treatment and Follow up HAN Lian-shu, YE Jun, QIU Wen-juan, ZHANG Hui-wen, WANG Yu, JI Wen-jun, GAO Xiao-lan,  LI Xiao-yan, JIN Jing, GU Xue-fan.Department of Pediatric Endocrinology and Genetic Metabolism, Shanghai Institute for Pediatric Research, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200092, China.Corresponding author：GU Xue-fan (Email:gu_xf53@yahoo.com.cn） Abstract  Objective  Many children were found with the low free carnitine level in blood  by tandem mass spectrometry technology. Some of cases are secondary to malnutrition, organic academia and other fatty acid oxidation metabolic diseases, and some of cases are primary carnitine deficiency (PCD). In the present study, we discussed the diagnosis of PCD and evaluate the efficacy of carnitine in the treatment of PCD. Methods We measured the free carnitine (C0) and acylcarnitine levels in the blood of 270,000 neonates from newborns screening program and 12,000 children with suspected clinical inherited metabolic diseases by tandem mass spectrometry. The mutations of carnitine transporter protein were tested to the children with low C0 level and the diagnosis was made. The children with PCD were treated with 100~300mg/Kg of carnitine. Results  Seventeen children were diagnosed with PCD, 6 from newborn screening program and 11 from clinical patients. Mutations were found in all of them. The average C0 level (2.9±2.0μmol/L) in patients was lower than the reference value (10mmol/L), along with decreased level of different acylcarnitines. The clinical manifestations were diverse. For the 6 patients form newborn screening, 4 were asymptomatic, 1 showed hypoglycaemia and 1 showed movement intolerance form 2 years old. For the 11 clinical patients, 8 showed hepatomegaly, 7 showed myasthenia, 5 showed myocardiopathy, 1 showed chronic abdominal pain, and 1 showed restlessness and learning difficulty. Among these patients, 14 cases were treated with carnitine. Their clinical symptoms disappeared 1 to 3 months later. The C0 level in the blood rose to normal, with the average from 4.0±2.7mmol/L to 20.6±8.3mmol/L (P<0.01). However, the level was still lower than the average level of healthy children（27.1±4.5mmol/L，P<0.01). Conclusion  Seventeen patients were diagnosed with PCD by the test levels of free carnitine and acylcainitines in blood with tandem mass spectrometry, and gene mutation test. Large dose of carnitine had  a good effect in treatment for the PCD patients.Keywords: Primary carnitine deficiency , Carnitine, Tandem mass spectrometry, Ttreatment原发性肉碱缺乏症（Primary carnitine deficiency，PCD，OMIM212140）是常染色体隐性遗传的脂肪酸β氧化代谢病。该病主要由于SLC22A5基因突变导致肉碱转运蛋白OCTN2功能缺陷所致。自1975年首例PCD患者报道以来，该病逐渐受到重视，尤其是近10余年串联质谱的应用，越来越多的患者得到诊断及治疗[1]。PCD可于任何年龄发病，主要表现为扩张型心肌病、肝肿大、肌无力等，若不及时治疗，可导致死亡，故早期诊断、及时治疗是改善该病患者预后的关键[2]。目前我国有关此病的报道甚少。2003年1月至2011年9月上海交通大学医学院附属新华医院小儿内分泌遗传代谢病科利用串联质谱技术对筛查新生儿及临床遗传代谢病疑似患儿进行血游离肉碱及酰基肉碱水平检测，结合基因突变检测进行PCD诊断，对确诊患者给予左旋肉碱治疗，探讨PCD的诊断与治疗。对象与方法一、对象1. 新生儿：为本科室常规筛查的在上海市出生的新生儿，共27万例，年龄出生后3天～7天，无临床症状。2.临床疑似遗传代谢病的患儿：来自本院儿科门诊及全国其他医院的临床患儿，共1.2万例。主要症状为发育落后、智力低下、易疲劳、运功不耐受及反复呕吐或腹痛；主要体征为肝肿大、心脏扩大及肌无力；实验室检查主要为：肝功能异常、肌酸激酶增高及低血糖等；影像学检查表现为：肝大、心肌肥厚。3. 健康儿童25例作为对照组，8例为新生儿来自我科新生儿筛查样品，男女各4例；17例来自我院儿保科体检儿童，男5例，女12例，年龄中位数1.2岁（5个月～5岁），通过血串联质谱检测除外肉碱缺乏。所有检查均获得新生儿及患儿家长或监护人的知情同意。二、检测方法1.血游离肉碱及酰基肉碱检测：采用串联质谱干血滤纸片法检测，检测方法参考文献[3]报道的方法。2.诊断方法：（1）血游离肉碱及多种酰基肉碱降低，其中新生儿患儿排除母源性肉碱缺乏；（2）肉碱转运蛋白的编码基因检测到突变。三、治疗与随访对确诊病例采用左旋肉碱替代治疗，具体剂量依据病情及治疗效果进行调整。急性期静脉给药，剂量为200～300 mg/(kg·d)，并同时对症支持治疗；稳定期口服给药，剂量为100～200 mg/(kg·d)，一般分3次给药。治疗初期2～3周门诊随访1次，血游离肉碱正常且稳定后1～3个月门诊随访1次，治疗期间定期相关检查，及时调整治疗。随访监测项目：体格检查、血酰基肉碱谱、血糖、血氨、肝功能、肌酸激酶、心肌酶谱、血红蛋白检测等；影像学检查包括腹部超声、超声心动图；以及评估生长、智力及运动发育情况。随访时间3个月～3年。四、统计学分析采用SSPS 13.0统计软件进行统计学分析，治疗前、治疗后及对照组三组间比较采用“多个样本比较的秩和检验”，治疗前后的比较采用“配对设计资料的符号秩和检验”，治疗前后分别与对照组的比较采用“两样本比较的秩和检验”，，以P＜0.01为差异有统计学意义。结  果一、 确诊患儿特点共确诊PCD的患儿17例，其中6例来自新生儿筛查，男女各3例，诊断时均无症状；实验室检查提示肌酸激酶升高1例，低血糖1例，其尿气相质谱显示轻度二羧酸尿。11例来自临床患儿，女8例，男3例，年龄中位数为1岁（4个月～6岁），临床主要症状包括易疲劳、肌力差7例，Reye综合征样发作3例，反复呕吐2例，饥饿不耐受2例，长期腹痛1例,多动、学习困难1例；体检发现肝肿大8例、心脏扩大6例；实验室检查发现谷丙转氨酶及谷草转氨酶升高7例，肌酸激酶增高5例，低血糖5例，贫血4例，血氨升高3例，乳酸升高3例，甘油三酯增高1例。尿气相质谱检测结果正常。影像学检查提示肝大8例、扩张型心肌病4例、肥厚型心肌病2例及脂肪肝1例。二、治疗后患儿临床表现变化新生儿筛查诊断的6例患儿，5例接受治疗，在随访期间持续无症状；1例未治疗的患儿2岁时表现出运动不耐受。11例出现临床症状的患儿，有2例未来得及治疗即死亡，分别为4个月女婴和6个月男婴，均死于心力衰竭；其余9例均接受治疗，治疗后3个月临床症状得到完全缓解，生长、智力及运动发育正常，对肉碱治疗无明显不良反应。三、治疗后患儿常规检查结果变化治疗前出现常规生化异常患儿，各项指标在治疗后2周～2月内恢复正常，心功能不全者射血分数及心脏收缩力好转，脂肪肝情况改善。四、治疗前后患儿血游离肉碱及酰基肉碱变化17例PCD患儿治疗前血游离肉碱水平[（2.85±1.87）μmol/L]，低于正常儿童下限值，与对照组[（27.09±4.49)μmol/L，P<0.01 ] 比较差异有统计学意义，其他不同种类的酰基肉碱水平除辛酰肉碱及葵酰肉碱外，也低于正常儿童下限值。随访的14例患儿治疗前后游离肉碱及其他酰基肉碱水平变化见表1.1及表1.2。给予左旋肉碱治疗后，患儿血游离肉碱水平均升至正常范围，但仍低于对照组儿童，差异有统计学意义（P<0.01< font="">）。其他酰基肉碱治疗后均升至正常，其中乙酰肉碱、己酰肉碱及肉豆蔻酰肉碱水平治疗后与对照组比较，差异无统计学意义，其他酰基肉碱仍低于对照组儿童，差异有统计学意义（P值均<0.05< font="">）。另外，1例患儿在治疗过程中左旋肉碱大幅减量后，2例患儿停药后，出现游离肉碱及多种酰基肉碱迅速降低，再次增加剂量后，血浆肉碱水平恢复至正常。表1.1  原发性肉碱缺乏症患儿治疗前后游离肉碱及不同种类酰基肉碱水平变化[M(最低值～最高值),mmol/L] 注：C0：游离肉碱；C2：乙酰肉碱；C3：丙酰肉碱；C4：丁酰肉碱；C5：异戊酰肉碱；C6：己酰肉碱表1.2  原发性肉碱缺乏症患儿治疗前后游离肉碱及不同种类酰基肉碱水平变化[M(最低值～最高值),mmol/L]                                                                                                注： C8：辛酰肉碱；C10：葵酰肉碱；C12：月桂酰肉碱；C14：肉豆蔻酰肉碱；C16：棕榈酰肉碱；C18：十八碳酰肉碱 讨  论肉碱的主要功能是协助脂肪酸进入线粒体进行β氧化代谢，为机体提供能量 [4，5]。体内肉碱主要来自肉类食物，少部分由肝脏及肾脏合成。肉碱需要由细胞膜上的肉碱转运蛋白的转运进入血液和细胞内利用。其编码基因SLC22A5突变导致肉碱转运蛋白转运功能下降[6]，食物中的肉碱不能由胃肠道吸收入血液，导致血浆及细胞内肉碱及酰基肉碱水平降低。肉碱缺乏导致脂肪酸氧化代谢障碍，能量及酮体生成减少，糖异生减少，对机体造成损伤。不同国家或地区的PCD的患病率从1:40 000到1:120 000不等，人群中杂合子的发生率为0.5%～1%[7]。本筛查中心新生儿筛查出6例患儿，患病率为1:45 000。该病的临床表现多样，主要表现在肝脏、心脏、及肌肉异常。不同患者表现类型不同。以肝脏受累为主者，主要表现为：肝肿大、脂肪肝、肝功能异常等；以心脏受累为主者，常表现为：心律失常、心腔扩大、心室壁肥厚、心功能降低等；以肌肉受累为主者，主要表现为：肌无力、肌张力减退、肌痛、运动不耐受、肌肉型肌酸激酶升高、肌纤维内脂质沉积等。另外，反复腹痛、呕吐、胃食管反流等消化道症状，贫血以及反复感染等表现也有报道。心肌病和骨骼肌病发病较为隐匿，以年长患儿多见[2]。部分患儿诊断时仅以扩张型心肌病为唯一表现[8]，本研究中6例表现为心肌病，其中4例为扩张型心肌病。肝损患儿可表现为抽搐、进行性意识障碍，常被误诊为Reye综合征发作，本研究中8例患儿肝肿大，其中3例有Reye综合征表现。PCD是潜在的致死性疾病，猝死患儿死因多为急性能量代谢障碍危象或急性心衰。本研究中2例患儿急性起病猝死。PCD一般不引起神经系统损伤，但当机体能量供应严重不足而未得到及时纠正时，可造成中枢神经系统不可逆损伤，影响患儿智力及运动发育。PCD的诊断主要依据临床表现、全血或血浆游离肉碱水平降低及基因突变分析。串联质谱技术仅用一滴血即可检测全血中的游离肉碱及不同种类的酰基肉碱水平，可用于检测PCD及其他多种脂肪酸b氧化代谢病[9]。Lund等[10]用串联质谱回顾性研究10名已确诊的PCD患儿，发现以游离肉碱为标准时诊断准确率为100%，证实串联质谱适用于PCD的诊断。本研究中患儿游离肉碱均值只有2.9mmol/L,远低于正常下限值10.0mmol/L。但也有报道该病的新生儿筛查可能出现漏诊，Lee等[11]通过临床分析推测新生儿筛查的漏诊率高达50%。可能与游离肉碱能通过胎盘从母体转运给胎儿有关，导致筛查时出现假阴性。另外，若母亲是PCD患者或因其他原因导致自身肉碱缺乏，则胎儿在宫内的肉碱供应不足及母乳中肉碱缺乏，婴儿生后出现母源性肉碱缺乏，造成假阳性。有许多PCD成年女性患者是通过筛查其孩子时被发现的[11-13]。本科室也已经发现3例母源性肉碱缺乏。不同种类酰基肉碱是不同种类的酰基辅酶A与游离肉碱结合而成。血游离肉碱降低到一定程度，血酰基肉碱也会降低，故检测游离肉碱水平的同时检测不同种类的酰基肉碱更有助于肉碱缺乏症的诊断，并可根据治疗前后酰基肉碱的变化，进一步判断左旋肉碱治疗的效果，有助于调整左旋肉碱的剂量。另外，诊断PCD需除外继发性肉碱缺乏，常见原因：（1）早产儿，由于肾小管功能未完全成熟导致肉碱丢失；（2）有机酸血症及脂肪酸氧化代谢病，由于这类疾病发作时喂养困难，肉碱摄入减少，体内有机酸增加导致肉碱消耗增加；（3）肾脏透析患者，肉碱丢失增加；（4）肉碱摄入不足，如营养不良、长期素食或短肠综合征患者等。故PCD的诊断依赖于SLC22A5基因突变分析，以便排除继发性肉碱缺乏症[14]。本研究17例患儿均经过基因突变证实。PCD的治疗主要药物为左旋肉碱。已有研究及长期随访证实，患者对其治疗效果较好，可完全恢复健康[15,16]。对于无症状的PCD患者，也需要补充左旋肉碱，可有效预防发病或猝死。左旋肉碱的治疗剂量需根据病情、血游离肉碱和酰基肉碱水平的变化进行调整。急性期静脉给药，剂量为100～400 mg/(kg·d)，稳定期口服给药，剂量为100～300 mg/(kg·d)，一般分次给药，以维持体内血浆肉碱水平的稳定[16]。当患者在感染、手术、禁食等能量需求增大时，应酌情增加左旋肉碱的口服剂量，必要时可考虑静脉给药。左旋肉碱治疗副作用少，大剂量可能引起腹泻、恶心等胃肠道不适，减少剂量可缓解。本研究14例患儿应用左旋肉碱后，临床症状及血生化异常均在2周～2月得到改善，1～3个月血游离肉碱升至正常范围，无急性发病和猝死病例，患儿智力、运动及生长发育与正常同龄儿童相当，且无明显不良反应，表明左旋肉碱疗对PCD有较好的疗效。除左旋肉碱治疗外，我们还给予部分患儿乙酰肉碱治疗，50～100 mg/(kg·d),口服给药，证实有助于患儿病情的恢复。目前认为，PCD患者需规律且终身服用左旋肉碱，以免病情发作[11]，也有擅自停药患者反复低血糖、甚至猝死的报道[17]。本组随访治疗的14例患儿中，有1例在药物大幅减量后，2例停药后，出现游离肉碱及种酰基肉碱迅速降低，增加剂量后，血浆肉碱水平重恢复至正常，证实长期补充左旋肉碱对于维持血浆肉碱稳定的重要性。除应用左旋肉碱对因治疗外，急性发作期需要对症治疗，尤其急性能量代谢危象时，应立即静脉给予足量葡萄糖，并积极纠正酸中毒，可避免致残、致死，改善患儿预后。另外，在左旋肉碱的长期治疗中，应注意避免饥饿、长时间运动等，可有效提高疗效，预防急性发作及猝死。一般无特殊饮食要求，但有学者通过PCD的动物模型研究指出，低脂饮食，尤其是限制长链脂肪酸摄入，有助于改善心肌肥厚[18]。综上所述，串联质谱技术适用于PCD的新生儿筛查和临床疑似病例的诊断，对于检测阳性患儿需要基因检测进行确诊。左旋肉碱是治疗PCD的首选药物，效果肯定，但需终身服用。

胡宇慧  韩连书  叶军  邱文娟  张雅芬 杨艳玲  刘丽  麻宏伟  高晓岚  顾学范 [摘要]  目的  研究丙酸血症患儿丙酰辅酶A羧化酶PCCA和PCCB基因突变情况。方法  应用PCR扩增和直接测序对11例丙酸血症患儿PCCA和PCCB基因的各个外显子及其两侧侧翼序列进行突变检测，并对部分患儿父母进行相应突变基因检测。结果  6例患儿为PCCA突变，5例为PCCB突变。共发现13种突变，其中10种突变未见文献报道，突变类型包括错义突变、缺失突变、剪切位点突变和复杂型插入缺失突变，错义突变为最常见类型。167-179del13ins1复杂型插入缺失突变在2例患儿中为纯合突变。结论  在11例丙酸血症患儿中检测到13种突变，其中10种为新突变类型，为今后有关丙酸血症的发病机制研究提供理论依据。上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书[关键词] 丙酸血症；基因突变；外显子；Gene mutation analysis in patients with Propionic acidemiaHU Yu-hui, HAN Lian-shu, YE Jun, QIU Wen-juan, ZHANG Ya-fen, YANG Yan-ling, LIU Li, MA Hong-wei, GAO Xiao-lan, GU Xue-fan. Shanghai Institute of Pediatics, Xinhua Hospital, Medical college of Shanghai Jiaotong University, Shanghai, 200092, China.Corresponding author: HAN Lian-shu（ Email: xhhanlianshu@Yahoo.com.cn）[Abstract] Objective  Propionic acidemia is a common organic acidemia, caused by deficiency of propionyl-CoA carboxylase (PCC), which catalyze the carboxylation of propionyl-CoA to D-methylmalonyl-CoA.PCC is a dodecameric enzyme of α-PCC and β-PCC subunits, nuclearly encoded by genes PCCA and PCCB, respectively. Mutation in either gene cause Propionic acidemia, the PCCA gene is located on chromosome 13q32 with 24 exons and the PCCB gene is located on chromosome 3q13.2-q22 with 15 exons. In this study, we analyzed gene mutations of 11 PCCA and PCCB deficient patients from China and to explore the possible mutation spectrum of Chinese patients. Methods  All 39 exons of PCCA and PCCB genes in 11 unrelated Chinese PA patients were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) and direct sequencing. Genomic DNA was extracted using Phenol-Chloroform method from the peripheral blood leukocytes of each patient. PCR amplification products were checked by 1.8% agarose gel electrophoresis and were subsequently sequenced with ABI 3700 Automated DNA Sequencer. Results  We identified 12 PA mutations, 7 affecting the PCCA gene, 5 affecting the PCCB gene, including 9 novel mutations and 3 previously reported mutations. Three missense mutations (1079T>G, 1102G>C and 1850T>C) and one short deletion (1863delA) were found in α-PCC subunit while three missense mutations (484G>A, 601G>A and 1253C>T) and two short insertion-deletions (167-179del13ins1, 560-561delCCinsT) were found in β-PCC subunit. The 167-179del13ins1 change was identified in two homozygous PA patients, with allelic frequency of 40% in β-PCC subunit deficiencies. Conclusion  Twelve mutations were found in 11 Chinese PA patients including nine novel mutations. No mutation is predominant in Chinese PCCA and PCCB deficient patients.[Key words] Propionic acidemia；Exon；Mutation 丙酸血症（propionic acidemia, PA）是一种较常见的有机酸血症，系丙酰辅酶A（CoA）羧化酶活性缺乏，导致体内丙酸及其代谢产物前体异常蓄积，进而出现一系列生化异常与神经系统损害症状，属于常染色体隐性遗传病。由于酶缺陷程度不同，临床表现个体差异较大。典型临床症状表现为喂养困难、反复呕吐、酸中毒、惊厥和嗜睡等。丙酰CoA羧化酶为α，β两个亚单位组成的α6β6多聚体，α和β亚单位的编码基因分别为PCCA（MIM 232000）和PCCB（MIM 232050），两个基因的突变均会导致丙酸血症。PCCA基因定位于染色体13q32，含24个外显子，至今已发现54种基因突变；PCCB基因定位于3q13.3-q22，含15个外显子，共有56种突变报道[1]。为了解我国PA患儿丙酰CoA羧化酶PCCA基因和PCCB基因突变类型，本研究自2006年9月至2007年9月对11例中国PA患儿进行了基因突变分析。对象和方法一、对象PA患儿11例：分别来自本院、北京大学第一医院儿科、广州市儿童医院和中国医科大学第二临床学院，其中5例收集了患儿父母的DNA。11例患儿均经串联质谱测定血中丙酰肉碱和甘氨酸，经气相色谱-质谱测定尿3-羟基丙酸和甲基枸橼酸确诊，诊断依据为丙酸血症的异常代谢产物，并参考既往文献[2,3]。同时通过血、尿常规、血气分析、血氨、血糖、血乳酸、肝肾功能和心肌酶谱测定等辅助检查了解病情程度。11例患儿相互间无血缘关系，父母系非近亲婚配。所有检查均获得患儿家长或监护人的知情同意。对照组为50例无血缘关系的健康成年人。二、          方法1. DNA提取：抽取患儿及部分患儿父母外周静脉血各4 ml，经抗凝后分离白细胞，使用苯酚-氯仿法提取DNA，－20°C保存。2. 基因突变检测：利用PCR扩增DNA、直接测序检测基因突变：（1）引物设计与合成：22对PCCA引物应用引物设计软件Primer premier 5.0和Oligo 6.0自行设计，引物覆盖PCCA基因23对外显子及其两侧的侧翼序列（表1），另一对PCCA引物依据已发表文献合成[4]；15对PCCB引物皆依据Rodríguez-Pombo等[5]于1998年发表的文献设计。引物由上海赛百盛和上海生工公司合成。（2）PCR扩增：PCR反应体系为10×buffer 5 ml，12.5 mmol/L dNTPs 8 ml，引物各12.5 pmol/L 2ml，50 ng DNA 2 ml,去离子水补足50 ml。在PCR仪上首次变性温度为94°C、5 min，然后按变性温度94°C、1 min，退火温度51～63°C、45 s~1 min，延伸温度72°C、1 min，循环32～34圈，最后72°C延伸10 min。取4ml PCR产物，用1.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定目的条带。（3）PCR产物测序分析，使用博大泰克DNA片段快速胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化，纯化产物在ABI 3700测序仪上测序（上海基康公司）。突变或多态性位点通过比较GenBank 中PCCA DNA 序列(NC_000013.9；GI:4557818)和PCCB DNA序列（NC_000003.10；GI:89161205）确定。突变的命名参照http://www.hgvs. org/mutnomen 提供的命名法。突变阳性结果均经反向和重复测序证实。新突变通过查阅PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.giv/PubMed) 已报道的突变和PA数据库(http://www.uchsc.edu/cbs/pcc/pccmain.htm) 来确定，并在对照组中检测，排除多态性。结  果一、PA患儿的临床资料和实验室特点PA患儿发病年龄为3天~8个月，临床表现主要为呕吐、嗜睡、惊厥、喂养困难和运动落后。实验室检查示酸中毒（血pH值6.9~7.3）、尿酮体（+）~（+++）、血乳酸增高（2.3~6.2 mmol/L，参考值< 2.0 mmol/L）和高血氨（94~300 mmol/L，参考值< 80 mmol/L）常见。串联质谱检测患儿干血滤纸片中丙酰肉碱水平（19.1±13.5，参考值< 5.0 mmol/L）、丙酰肉碱与游离肉碱比值(0.9±0.5，参考值<0.2)< font="">、丙酰肉碱与乙酰肉碱比值(1.8±0.7，参考值<0.3)< font="">和甘氨酸（702.9±198.4，参考值< 400 mmol/L）显著增高。气相色谱-质谱检测患儿尿液中3-羟基丙酸和甲基枸橼酸显著增高。二、PA患儿突变检测结果在11例PA患儿中发现13种基因突变类型（表2），包含9种错义突变、1种剪切位点突变和3种插入缺失突变（图1~图13）。其中1079T>G（图2）、1102G>C（图3）、1850T>C（图5）、1863delA（图6）、716-2A>G （图8）167-179del13ins1（图9）、560delCCinsA（图10）、484G>A（图11）、601G>A（图12）、c.1253C>T（图13）为新发现突变，正常对照组中未发现这10种突变。在6例患儿中检测到PCCA基因突变共8种，其中2例仅找到1个突变。对3例患儿父母的DNA进行了检测，病例5为716-2A>G （来自父亲）和2002G>A（来自母亲）杂合突变。病例2和病例6仅找到1个突变，分别为 1079T>G（来自母亲）和 2002G>A（来自父亲）。在5例患儿中检测到PCCB突变5种，3例为纯合突变，1例为杂合突变，1例仅找到1个突变。病例8为167-179del13ins1插入缺失纯合突变，在cDNA166和180位之间缺失碱基ACGCGCAGCACAA插入碱基C，其父母分别携带167-179del13ins1突变；病例9为484G>A（G162R）纯合突变，父母及姐姐为该突变的携带者；病例11仅检测到一个突变1253C>T（来自母亲）。讨  论丙酸血症是一种常见的有机酸血症，近几年我国在对PA的诊断和治疗方面已取得较大进步[6-8]，但尚未进行PA分子生物学相关研究。丙酸血症的临床确诊依赖于特殊的生化诊断，包括串联质谱检测患儿干血滤纸片中丙酰肉碱水平、丙酰肉碱与游离肉碱比值、丙酰肉碱与乙酰肉碱比值和甘氨酸显著增高；气相色谱-质谱检测患儿尿液中3-羟基丙酸和甲基枸橼酸显著增高。基因分析可以了解该病的分子生物学特征。本研究在11例PA患儿中检测到13种突变，其中PCCA基因突变8种，PCCB基因突变5种。PCCA基因上突变集中于外显子21、13和22，PCCB基因上突变集中于外显子1、5和6。国外文献报道PCCA基因突变和PCCB基因突变分别于外显子13、12、19和18及外显子12、15、11和6常见，且不同国家不同民族间PA突变谱存在较大差异。在日本患者的PCCA基因中，922-923insT、1644-6C>G和R399Q突变占56%[9]。有关PCCB基因突变研究显示，日本患者中T428I、R410W和A153P突变分别占30％、26.7％和13.3%[9]，在高加索人患者中1218del14ins12（ins/del）突变最常见[10]，在西班牙和拉丁美洲患者中1172-1173insT和E168K突变较常见[11]，韩国患者中T428I最常见（56.3%）[12]，格陵兰因纽特人患者中1540insCCC突变最常见[13]。本研究未检测到上述热点突变，可能与种族不同有关。PCCA包含两个功能单位，N-端的生物素羧化酶位点和C-端的生物素结合位点，本研究中检测到的8种PCCA突变（除716-2A>G外）所致的氨基酸改变均位于PCCA基因编码蛋白的两个功能区。PCCB基因中167-179del13ins1插入缺失突变在例7和例8患儿中为纯合突变，有可能为中国人群PCCB基因的常见突变。另外，在11例患儿中1850T>C 、2002G>A和484G>A突变类型均为2个等位基因突变，但因本研究中例数较少，尚不能确定是否为中国人群热点突变。例2、例6和例11仅发现1个等位基因突变，本研究未进行非翻译区、翻译调控区和基因启动子区突变检测，因此不排除在这些区域中存在突变。在本研究检测到的13种突变中3种为已报道突变，其中PCCA基因229 C>T突变在高加索人群、日本人群和西班牙人群中均有报道[11,14,15]，可能为较广泛的突变；PCCA基因2002G>A突变在美国人群曾有报道[16]；1118T>A在西班牙人群中发现1例[15]。在10种新突变中PCCA基因有5种（716-2A>G 、1079T>G、1102G>C、1850T>C和1863delA）、PCCB有5种（167-179del13ins1、484G>A、560delCCinsA、601G>A和1253C>T），这些突变可能导致转录过程中外显子的跳跃、翻译中mRNA终止密码提前出现和翻译后产物的降解加速，翻译过程中抑制了α-β和/或β-β亚单位之间的相互作用，影响亚单位之间的装配而不能形成功能性丙酰CoA羧化酶低聚物[17]。716-2A>G突变位于ag-gt剪切位点上，可能导致转录过程中外显子10无法剪切，引起外显子10的跳跃；缺失突变1863delA导致cDNA 1873-1875位出现UGA终止密码，翻译后蛋白截短104个氨基酸。插入缺失突变中167-179del13ins1致使终产物减少4个氨基酸（谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸）；560delCCinsA在原位出现UAG终止密码，蛋白质截短353个氨基酸。错义突变中1102G>C导致氨基酸发生酸碱性改变，由酸性天冬氨酸变为碱性组氨酸；484G>A导致氨基酸极性改变，由非极性疏水性甘氨酸变为极性碱性精氨酸；1079T>G、1850T>C、601G>A和1253C>T未导致氨基酸极性和酸碱性改变。突变对酶蛋白的功能影响具有多样性，这6种错义突变对酶蛋白功能的影响需要进一步研究。对6例PA患儿父母进行突变基因检测，证实患儿突变基因均来自父母遗传，非新生突变。本研究对PA患儿基因突变进行了初步分析，由于例数偏少，尚不能进行基因突变类型与临床表型相关分析，今后随着病例的增多，将可明确基因突变类型和临床表型间的关系，有助于PA发病机制研究，指导临床治疗和预后，并可对有需要的患儿家庭提供产前基因诊断。参考文献[1]  Desviat LR, Clavero S, Perez-Cerdá C, et al. New splicing mutations in propionic acidemia. J Hum Genet, 2006, 51:992-997.[2] Chace DH, Kalas TA. A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing. Clinical Biochemistry, 2005, 38: 296– 309. [3] Kuhara T. Diagnosis and monitoring of inborn errors of metabolism using urease-pretreatment of urine, isotope dilution, and gas chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography B, 2002, 781:497-517.[4]  Campeau E, Desviat LR., Leclerc D, et al. Structure of the PCCA gene and distribution of mutations causing propionic acidemia. Mol Genet Metab, 2001, 74:238-247.[5]  Rodríguez-Pombo P, Hoenicka J, Muro S, et al. Human propionyl-CoA carboxylase beta subunit gene: exon-intron definition and mutation spectrum in Spanish and Latin American propionic acidemia patients. Am J Hum Genet, 1998, 63:360-369.[6]  杨艳玲，张月华，山口清次，等. 六例丙酸血症的诊断和治疗分析. 中华儿科杂志，2001，39:170-171.[7]  顾学范，韩连书，高晓岚，等. 串联质谱技术在遗传性代谢病高危儿童筛查中的初步应用. 中华儿科杂志，2004，42:401-405.[8]  韩连书，高晓岚，叶军，等. 串联质谱技术在有机酸血症筛查中的应用研究. 中华儿科杂志，2005,43:325-330.[9]  Yang X, Sakamoto O, Matsubara Y, et al. Mutation spectrum of the PCCA and PCCB genes in Japanese patients with propionic acidemia. Mol Genet Metab, 2004, 81:335-342.[10]  Campeau E, Dupuis L, Leclerc D, et al. Detection of a normally rare transcript in propionic acidemia patients with mRNA destabilizing mutations in the PCCA gene. Hum Mol Genet, 1999, 8:107-113. [11] Pérez B, Desviat LR, Rodríguez-Pombo P, et al. Propionic acidemia: identification of twenty-four novel mutations in Europe and North America. Mol Genet Metab, 2003, 78:59-67.[12] Kim SN, Ryu KH, Lee EH, et al. Molecular analysis of PCCB gene in Korean patients with propionic acidemia. Mol Genet Metab, 2002, 77:209-216.[13] Ravn K, Chloupkova M, Christensen E, et al. High incidence of propionic acidemia in greenland is due to a prevalent mutation, 1540insCCC, in the gene for the beta-subunit of propionyl CoA carboxylase. Am J Hum Genet, 2000, 67:203-206.[14] Ohura T, Narisawa K, Iinuma K. Mutation analysis of the propionyl-CoA carboxylase alpha-subunit gene in four Japanese patients with propionic acidaemia. J Inherit Metab Dis. 1999, 22:851-852.[15] Richard E, Desviat LR, Pérez B, et al. Genetic heterogeneity in propionic acidemia patients with alpha-subunit defects. Identification of five novel mutations, one of them causing instability of the protein ,1999,1453:351-358.[16] Campeau E, Dupuis L, Leclerc D, et al. Coding sequence mutations in the alpha subunit of propionyl-CoA carboxylase in patients with propionic acidemia. Mol Genet Metab,1999, 67: 11-22. [17] Muro S, Pérez B, Desviat LR, et al. Effect of PCCB gene mutations on the heteromeric and homomeric assembly of propionyl-CoA carboxylase. Mol Genet Metab, 2001, 74:476-483.表1   PCCA基因编码区PCR扩增正反引物序列外显子正向引物反向引物1GGGCATCGGGTTTCTGGCTCGAGGGAGGAAAGCAAGCGGTGTA2TCGCTAGAACCTAACTGGAAGCCCACAATGAAAAACAGAATAC3-4GTTATATTCAGTGTTGATGTTGGGTGATACTGTCGTTTTGCTT5TTCCTGAGTTTATTTGTTGCTTTCAATCATTCTTTCCTATTT6GGGCTCTTGAACAGTAAATAAAAACCACTTCACTTGTCAC7ATACACATATGGGCTTTTCTTTTAATACATGTATGTATGTGCGTGCAT8GAATGAAAAGGGTTAGAAGGTAGCAGAGCAACAAGTAATCAAAATC9TACTTTCCTGGTGTTATTTTCCATTTCAATCTTTTTCCCATTC10AGTCTGACTCTTCTTCTCCTTCGCACAACTCACAATCATTCTA11TTACTCGTTGTATTTGAAAGGTGGCGTCAGTGAATGATGAATG 12TGTAATGCACACAAAAGATAACCATGGAGAGGAATAAATAACAG13TTGTGATTTTTCTTGTTTGTTTCTTTAACCAATGCTCTGTTGC14ACCATATGTTGAAAATAGACCTAGAACACCACAAAATACTGAA15TTTAGATTGTTTTCCTATTTTCCCTTTCACATTTACATCAGTGC16TCGAGATATATTTAGAAATCTGTTAT[2]TCGAGATATATTTAGAAATCTGTTAT[2]17AAGGAAATAAGTAATCTTGAATGGAAATCATGAATGTAAACAGTCTTG18TAGGAGAGAAGCACAGATGTTACTTCTCCAAAGACCCATAAG19TGTTTAAAATGTTCGCAAATACTACTACAAATTCAAAAGACGAGAG20GCAGTAAACATGACAGGTTGAATACAGCTTTTCCCTCCTA21TTGGCTATCGTGAACATTACATACATGGTGAAACCTCATCTTTAGAAA22CAATTGAGAACCATTTGAATGTCGGTTAAGTAAGAACTGC23GACACATATTTTGGGGCATTTGTGTAGAAGCGAGGGGGAGAG24GACAGAGGAGACGGGAAAGGAAGGATCACAAAGAAATGCTGGTA  注：正、反向引物序列方向均为5’端到3’端表2   9例PA患儿PCCA和PCCB基因突变检测结果基因病例突变1突变2外显子碱基突变氨基酸改变外显子碱基突变氨基酸改变PCCA13229 C>TR77W211850T>CaL617P 2131079T>GaV360G？   3131102G>CaD368H211850T>CaL617P 4131118T>AM373K211863delAa  5222002G>AG668R10716-2A>G  6222002G>AG668R？          PCCB71167-179del13ins1a 1167-179del13ins1a  81167-179del13ins1a 1167-179del13ins1a  95484G>AaG162R5484G>AaG162R 106560-561delCCinsAa 6601G>AaA201P 11121253C>TaA418V？  注：a为新发现突变类型图1~13   PA患儿13种基因突变图（箭头所示为突变位置）图1 例1 PCCA基因229C>T；图2 例2 PCCA基因1079T>C；图3 例3 PCCA基因1102G>C；图4 例4 PCCA基因1118T>A；图5 例1和例3 PCCA基因 1850T>C；图6 例4 PCCA基因1863delA；图7 例5和例6 PCCA基因2002G>A；图8 例5 PCCA基因716-2A>G；图9 例7和例8 PCCB基因167-179del13ins1；图10 例9 PCCB基因484G>A；图11 例10 PCCB基因560-561delCCinsA[反向测序]；图12 例10 PCCB 基因601G>A [反向测序]；图13 例11 PCCB基因1253C>T

中华儿科杂志，2005,43(5):325-330韩连书，高晓岚，叶军，邱文娟，顾学范[摘要] 目的 应用串联质谱技术通过检测干血滤纸片中的酰基肉碱谱，对遗传性代谢病高危儿童进行有机酸血症筛查和诊断研究。 方法 遗传性代谢病高危儿童1000例，男642例，女358例，年龄中位数为2岁(5天～15岁), 手指采血，滴于滤纸片上。取直径为3 mm的干血滤纸片放入96孔聚丙烯板，经含酰基肉碱内标的甲醇萃取，盐酸正丁醇衍生后，进行串联质谱分析。结果 在1000例高危儿童中筛查并诊断有机酸血症40例(4.0%)，其中甲基丙二酸血症20例，丙酸血症6例，异戊酸血症3例，戊二酸血症I型3例，戊二酸血症II型3例，3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症1例，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症1例，生物素酶缺乏症2例，b-酮硫解酶缺乏症1例。患者临床表现主要为运动和智力发育落后、抽搐、意识障碍、肌张力低下、呕吐和喂养困难等。常规实验室检查主要表现为酸中毒、高血氨、高乳酸血症和低血糖等。结论 串联质谱技术能够通过检测血滤纸片中的不同酰基肉碱浓度，对部分有机酸血症进行快速筛查和诊断，结合尿气相色谱/质谱技术，有助于提高有机酸血症诊断的准确性。上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书【关键词】 串联质谱；有机酸血症；酰基肉碱；遗传性代谢病Application of Tandem Mass Spectrometry in diagnosis of organic acidemias HAN Lian-shu, GAO Xiao-lan, YE Jun, QIU Wen-jun, GU Xue-fan. Department of Pediatric Endocrinology, Genetic and Metabolism, Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai Institute for Pediatric Research, Shanghai 200092, China [Abstract] Objective The diagnosis of organic acidemias is very difficult and need special test methods. Recently the tandem mass spectrometry had been used in screening and diagnosis of the inborn error of metabolism. The aim of the present study was to utilize a dry blood filter paper method for acylcarnitines profiles test using tandem mass spectrometry in diagnosis of organic acidemias in high risk children. Method One thousand patients (642 were males and 358 females) with high risk of inborn error of metabolism were studied, The median of their age is 2 years. The blood was collected on filter paper, punched and extracted into methanol solution with stable isotope labeled internal standards of acylcanitine, then derivatized with butanolic-HCI. After preparation, the samples were analyzed by tandem mass spectrometry. The volume of the acylcanitines was calculated by the special software. Results Forty patients (4.0%) were diagnosed as organic acidemias among the 1000 patients, including 20 methylmalonic acidemia, 6 propionic acidemia, 3 isovaleric acidemia，3 glutaric acidemia type I, 3 glutaric acidemia type II, 2 biotinidas deficiency, 1 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency，1 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase deficiency, and 1 beta-keto thiolase deficiency. The common clinical symptoms and signs of these patients were developmental and mental retardation, spasm, lethargy, coma, hypotonia, vomiting, and feeding difficult. Routine laboratory tests were suggested by metabolic acidosis, hyperammonemia, hyperlactonemia, hypoglycemia, anemia liver function abnormal. Conclusion An apart of organic acidemias can be fast diagnosed by tandem mass spectrometry through acylcarnitine profiles analysis in dry blood filter paper. The fast and accurate diagnosis of organic acidemias by tandem mass spectrometry will be rise by combine the gas chromatography mass spectrometry.[Key words] tandem mass spectrometry; organic acidemias; acylcarnitine; inborn error of metabolism有机酸血症主要是由于氨基酸、脂肪酸和糖代谢异常导致中间代谢产物－有机酸增加，而引起一系列病理生理改变和临床症状的一组疾病，由于患者尿中含有大量有机酸又称为有机酸尿症。我国以往由于检查条件的限制，有机酸血症诊断较困难，许多患者不能得到及早的诊断和治疗。气相色谱/质谱技术为有机酸尿症的诊断提供了条件。近几年发展的串联质谱新技术，通过快速检测血中酰基肉碱谱，为有机酸血症的筛查和诊断提供了新方法[1,2]。我们在国内率先开展串联质谱新技术进行遗传性代谢病的筛查和诊断[3]，现报告2003年1月～2004年10月1000例临床高危儿童有机酸血症筛查的结果和体会。对象与方法一、对象临床疑似遗传性代谢病高危儿童1000例，分别来自上海、北京、广州、香港、澳门等全国20余个省、市、特区的55所医院，其中男642例，女358例，年龄中位数为2岁(5天～15岁)。健康儿童780例，来自托儿所和幼儿园，男489例，女291例，平均年龄7岁。通过检测健康儿童的血酰基肉碱水平确定本实验室的正常上限值。所有检测均取得家长的知情同意。高危儿童临床表现包括反复呕吐、抽搐、昏迷或嗜睡、智力运动发育落后、生长发育迟缓、肌张力异常和肝脾肿大等，常规实验室检查提示有代谢性酸中毒、低血糖、高血氨、高乳酸血症等，均是原因不明者。标本采集用干血滤纸片法，手指采血或静脉抽血，滴于专用采血滤纸(S&S 903#)上，晾干后送检。二、试剂、材料和仪器1. 试剂：甲醇、盐酸正丁醇(3 mol/L)、乙腈和氮气。盐酸正丁醇(3 mol/L)由正丁醇和乙酰氯按9:1(v:v)配制。同位素内标：选用8种酰基肉碱的同位素内标对样品中20余种酰基肉碱进行定量，所有内标均购自美国剑桥同位素实验室，包括2H9-游离肉碱(2H9-carnitine, 2H9-C0)，2H3-乙酰肉碱（2H3-acetylcarnitine，2H3-C2），2H3-丙酰肉碱（2H3-propionylcarnitine，2H3-C3），2H3-丁酰肉碱（2H3-butyrylcarnitine，2H3-C4），2H9-异戊酰肉碱（2H9-isovalerylcarnitine，2H9-C5），2H3-辛酰肉碱（2H3-octanoylcarnitine，2H3-C8），2H9-肉豆蔻酰肉碱（2H9-myristoylcarnitine，2H9-C14），2H3-棕榈酰肉碱（2H3-palmitoylcarnitine，2H3-C16）。上述同位素内标用甲醇稀释成工作液，4°C冰箱保存，1个月内用完。2. 材料：96孔聚丙烯板，96孔过滤板(滤膜孔径0.45 mm)购自Millipore公司。3. 仪器：串联质谱仪(API 2000型)购自美国生物应用系统公司(Applied Biosysterms)，高效液相仪采用美国安捷仑公司(Agilent 1100)产品。三、测定方法1．样品处理：参考 [3, 4]报道的方法，取直径3 mm的干滤纸血片(相当于3.2 ml全血)，置于96孔过滤板中，每孔加入含酰基肉碱内标的甲醇溶液100 ml，室温放置20 min，萃取血片中的酰基肉碱，然后离心至另一个96孔聚丙烯板，50°C加热吹干，再加入60 ml盐酸正丁醇(3 mol/L)，Teflon 膜覆盖，置65°C恒温箱内15 min，随后50°C加热吹干，再加入80％乙腈100 ml溶解，铝膜覆盖，即可上样检测。2．仪器设置 流动相采用80％乙腈，四元泵流速设置为30 ml/min，自动进样器设置为每次进样20 ml。酰基肉碱测定采用母离子扫描方式，子离子质荷比(m/z)为 85，扫描范围为m/z 210～m/z 502，一个样品测试约需时间2.5 min。3．资料分析 定量分析采用软件ChemoView 1.2版本 (美国应用生物系统公司)，根据各种丁酯化的同位素内标和酰基肉碱的离子峰强度，由已知浓度的内标，自动计算出所测样品中酰基肉碱的浓度。质控样品采用美国疾病控制和预防中心（CDC）新生儿筛查质控部门提供的串联质谱酰基肉碱血滤纸片。四、有机酸血症的诊断有机酸血症患者在有机酸代谢途经发生障碍时导致其中间代谢产物增加，包括不同种类的酰基肉碱增高。各型有机酸血症的诊断依据串联质谱特异性酰基肉碱谱的改变，结合尿气相色谱/质谱有机酸分析、临床表现和常规实验室检查等确定。结 果一、筛查结果在1000例高危儿童中确诊有机酸血症40例（4%），见表1。其中甲基丙二酸血症(Methylmalonic Acidemias，MMA)最多(50%)，其次为丙酸血症(Propionic Acidemia，PA，15%)、异戊酸血症((Isovaleric Acidemia，IVA, 7.5%)、戊二酸血症(Glutaric Acidemia，GA)I型和II型(各7.5%)、生物素酶缺乏症(5%)、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症(3-Methyl Crotonyl-CoA Carboxylase Deficiency, 3-MCC)、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症(3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoA Lyase Deficiency, 3-HMC)及b-酮硫解酶缺乏症各1例。表1列出了不同有机酸血症对应的串联质谱检测参数（不同种类的酰基肉碱），以及这些参数的正常儿童上限值和患儿的检测值。表1 高危儿童有机酸血症串联质谱筛查结果疾病 n 异常标志 浓度 正常上限值 (％) (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L)甲基丙二酸血症 20(50) C3 11.24 5.00 C3/C0 0.58 0.20 C3/C2 1.34 0.30丙酸血症 6(15) C3 39.84 5.00 C3/C0 1.20 0.20 C3/C2 2.23 0.30异戊酸血症 3(7.5) C5 2.53 0.40戊二酸血症1型 3(7.5) C5DC 2.14 0.15戊二酸血症2型 3(7.5) 多种酰基肉碱增高3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症 1(2.5) C5-OH 2.42 0.603-羟-3-甲基戊烯二酰辅酶A裂解酶缺乏症 1(2.5) C5-OH 3.79 0.60生物素酶缺乏症 2(5.0) C3 8.75 5.00 C3/C0 0.18 0.20 C3/C2 0.31 0.30 C5-OH 5.50 0.70b-酮硫解酶缺乏症 1(2.5) C5-OH 2.31 0.70 C5:1 0.63 0.05注：C3为丙酰肉碱，C5为异戊酰肉碱，C5DC为戊二酰肉碱，C5-OH为3-羟基异戊酰肉碱，C5:1为异戊烯酰肉碱从表中可以看出患儿的检测值高于正常上限值数倍，甚至10余倍。MMA和PA患者均为丙酰肉碱(Propionylcarnitine，C3)增高，两者比较丙酸血症增高更显著(t=6.110, P<0.001)。另外，pa患者血甘氨酸(glycine，gly)增高(614< font="">±220)mmol/L(正常上限值<400 mmol/L)，MMA患者Gly平均浓度在正常范围（243±123）mmol/L，两者比较差异显著(t=5.231, P<0.001)。生物素酶缺乏症表现为c3和3-羟基异戊酰肉碱（3-hydroxyisovlerylcartine，c5-oh）增高，以5-oh增高显著。3-mcc和3-hmg均为c5-oh增高。< font="">正常儿童和PA、MMA、IVA、GAI患儿的串联质谱图见图1，不同疾病相对应参数的离子峰强度显著增高，与定量结果一致，PA和MMA均表现C3离子峰强度增高，PA患儿C3增高更显著。二、临床资料分析40例有机酸血症儿童中男23例，女17例，年龄20天～15岁，发病年龄1天～15岁，诊断年龄1个月～15岁，发病至诊断明确间隔时间23天～11年。其中34例患儿临床资料较完整，智力落后14例(41.2%)，抽搐10例(29.4%)，意识障碍（嗜睡或昏迷）11例(32.4%)，运动落后22例(64.7%)，肌张力低下14例(41.2%)，步态不稳3例(8.8%)，呕吐13例(38.2%)，喂养困难2例(5.9％)，肝脾肿大2例(5.9%)，肌肉疼痛1例(2.9%)。家族史阳性3例（8.8％），其中2例MMA患儿的姐姐已明确诊断为MMA，1例MMA患儿的同胞中有不明原因的夭折史。常规实验室检查显示高乳酸血症17例（50％）, 酸中毒11例(32.4％), 尿酮体阳性8例(23.5%)，高血氨7例(20.6%)，肝功能异常6例(17.6%)，贫血5例(14.7%)，肌酸激酶增高5例(14.7%)，低血糖4例(11.8%)，头颅CT或核磁共振检查异常8例(23.5%)，表现为不同形式的脑损害。 讨 论有机酸是氨基酸、脂肪酸、类固醇、碳水化合物或者某些药物在体内代谢的中间产物，由于代谢途经中某种酶的缺陷，导致其中间代谢产物和旁路代谢产物的增加，形成有机酸血症。在代谢过程中大部分有机酸需与辅酶A结合成酰基辅酶A才能逐步代谢，有机酸血症时同时导致大量酰基辅酶A的累积，酰基辅酶A与肉碱结合形成酰基肉碱，辅助有机酸的排出，所以患者体内相对应的酰基肉碱大量增加[5]。由于血中酰基肉碱属微量物质，结合其结构的特点，常规的实验室方法较难测定。既往有机酸血症的诊断常常依靠培养外周血白细胞或皮肤成纤维细胞酶活性测定，难于广泛应用，目前临床主要采用尿液气相色谱/质谱有机酸分析方法进行诊断。串联质谱技术将被测物质分子电离成各种质荷比不同的带电粒子，由一级质谱(MS1)选择一定质量的离子进入碰撞室产生子离子或中性分子，再经过二级质谱(MS2)检测，通过母离子与子离子或中性分子配对分析，显著提高了方法的特异性和灵敏性[6]。对于有机酸血症，串联质谱主要通过检测血液中不同的酰基肉碱的浓度进行筛查和诊断。Wilcken等[7]报道澳大利亚利用串联质谱进行新生儿遗传代谢病筛查后有机酸血症患病率较以前显著增加。本研究利用串联质谱技术，在高危儿童中有机酸血症的阳性率为4.0％。与气相色谱/质谱检测遗传性代谢病高危儿童相比较，国内杨艳玲报道阳性率为4.2％[8]，罗小平为3.7%[9]，巴西Wajner报道为4.2％ [10]，串联质谱技术与气相色谱/质谱技术对有机酸的检测阳性率比较接近。病种方面以MMA最多(50％)，其次为PA(15%)，与国内及其他国家结果一致[8, 10, 11]，至于IVA、GA-I和GA-II型等所占比例有所不同，可能与所用检测方法的不同有关。根据有机酸血症的发病机制，串联质谱技术对于某些有机酸血症可明确诊断，例如， C5显著增高可诊断IVA， C5DC单独增高可诊断GA-I型，多种酰基肉碱增高可诊断GAII型(又称为多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症)，甲基丙二酰肉碱(C4DC)和C3均增高可诊断MMA，C5-OH和C3均增高可诊断多种羧化酶缺乏症。部分有机酸血症串联质谱分析可表现为同一种酰基肉碱增高，如PA和MMA均为C3增高，本研究诊断为MMA的20例高危儿童，C4DC均正常。但根据发病机制由于PA直接引起C3增高，而MMA间接引起C3增高，所以理论上PA时C3增高更显著，这在本研究串联质谱的C3检测结果中得到证实，与Chace等[12]报道的一致。我们观察到C3大于30 mmol/L基本可排除MMA，诊断为PA，小于15 mmol/L基本可排除PA，诊断为MMA，C3介于15～30 mmol/L之间需进行尿有机酸分析进行鉴别。至于MMA患者C4DC不增高的原因可能与甲基丙二酰辅酶A不易与肉碱结合有关。虽然生物素酶缺乏症或多种羧化酶缺乏症也有C3增高，但同时伴有C5-OH增高，且以C5-OH增高为主，C3/C0和C3/C2正常，而MMA和PA 患者C3/C0和C3/C2显著增高，故易与PA或MMA鉴别。对于3-MCC、3-甲基戊烯二酰辅酶A 水解酶缺乏症和3-HMC串联质谱分析均表现为C5-OH增高，且增高的程度无显著差别，故单用串联质谱仅可提示为这三种疾病中的一种，不能确定是哪一种疾病，需要进行尿气相色谱/质谱分析进行鉴别。Koeberl报道[13]利用串联质谱技术在美国北佛罗里达州筛查出的8例C5-OH增高的新生儿，均确诊为3-MCC，表明在这三种疾病中，3-MCC的发病率可能较高。当然，尿液气相色谱/质谱分析对有机酸血症检测有其优点，但不足之处为标本处理成本高，分析时间较长，不适合大规模常规筛查。利用高灵敏、快速的串联质谱分析血酰基肉碱的优点，结合进一步的尿气相色谱/质谱分析，可使有机酸血症的诊断更加快速、准确。从本文患儿的临床和常规实验室检查结果分析来看，单靠临床症状和常规实验室检查不能够确定有机酸血症，当遇到原因不明的运动、智力发育落后、抽搐、意识障碍和肌张力低下等神经系统表现，或者有呕吐、喂养困难和肝脾肿大等多脏器损害的症状体征，在实验室方面有酸中毒、高血氨、高乳酸血症、低血糖、肝功能异常、贫血和酮症，或者头颅CT、核磁共振表现为不同形式的脑损害时，应考虑到有机酸血症或其他遗传性代谢病的可能，留取血样或尿样送到能够进行酰基肉碱、有机酸和氨基酸分析的实验室进行特异性检测。这样可及早诊断，及早治疗，避免或减轻不可逆的病理改变。本研究中患儿发病时间在1岁之内的占83.3%，而1岁内得到确诊的只占33.3％，明确诊断距发病时间超过1年者达45.8％。说明大部分患儿未能在发病后较短的时间内得到确诊和正确的治疗，导致在明确诊断时已出现不可逆的神经系统发育异常，其中2例患儿因病情已较重，在明确诊断后不久死亡。可见对于高危患儿进行特殊的检查非常重要。综上所述，串联质谱技术是检测有机酸血症的又一项新技术，该技术还能够同时对多种氨基酸代谢病和脂肪酸氧化障碍进行筛查和诊断，结合其检测速度快的优点，在一些发达国家已广泛应用于新生儿遗传代谢病的筛查，提高了筛查质量，提高了遗传代谢病的诊治水平。本研究为串联质谱技术在国内的应用和推广提供了经验。

(发表在：中华内分泌代谢杂志， 2012, 28(11):46-47.）韩连书 杨楠 叶军 邱文娟 张惠文 高晓岚 王瑜 李筱燕 许浩 顾学范上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书【提要】枫糖尿病患者12例，经给予限制天然蛋白质摄入、特殊营养粉及维生素B1治疗后，临床症状明显改善，血亮氨酸和缬氨酸水平较治疗前下降，差异显著（P＜0.01)，尿支链α-酮酸较治疗前下降，但差异不显著。【关键词】枫糖尿病；诊断；治疗 Analysis of diagnosis and treatment in twelve patients with maple syrup urine disease HAN Lian-shu, YANG Nan, YE Jun, QIU Wen-juan, ZHANG Hui-wen, GAO Xiao-lan, WANG Yu, LI Xiao-yan, XU Hao, GU Xue-fan.Department of Pediatric Endocrinology and Genetic Metabolism, Shanghai Institute for Pediatric Research, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200092, China.Corresponding author: Gu Xuefan, Email: gu_xf53@yahoo.com.cn【Abstract】 Twelve patients with maple syrup urine disease were treated with restrict natural protein intake, supplying the special nutrition powder, and Vitmin B1. The manifestations of these patients improved greatly after treatment. The levels of leucine and valine in blood of these patients decreased significantly after treatment. Although the level of branched-chain α-ketoacids in urine reduced, but no significant difference compared with theirs before treatment. .【Key words】maple syrup urine disease; diagnosis; treatment枫糖尿病（maple syrup urine disease ，MSUD）是一种支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)代谢紊乱疾病，属于常染色体隐性遗传病。其临床表现缺乏特异性。诊断主要依赖于血中支链氨基酸和尿中支链α-酮酸的水平升高。治疗主要以限制天然蛋白质摄入、同时给予特殊奶粉(不含缬氨酸、亮氨酸氨酸及异亮氨酸)为主；对于维生素B1有效型患者需要给予维生素B1治疗。早期诊断和治疗可有助于减轻和防止脑损伤，改善预后[1]。现总结2004年到2011年我科收治的12例患者的临床资料和质谱检测结果，报告如下。对象和方法一、 对象本研究室治疗并随访的MSUD患者12例，2例来自新生儿筛查，10例来自临床患者，男5例，女7例。年龄均值2.8岁(18天~7岁)。所有检测均经过医院伦理委员会同意及家长知情同意。二、诊断及分型1．诊断依据：(1)临床表现：新生儿早期出现呕吐、喂养困难或嗜睡，同时可伴有尿焦糖样异味，全身肌张力增高，角弓反张或肌无力。(2)血亮氨酸及缬氨酸水平增高。(3)尿支链α-酮酸水平增高。(4)维生素B1负荷试验：每天给予维生素B1 200～300mg/d口服，3周后复查血氨基酸及尿支链α-酮酸水平，判断维生素B1治疗是否有效。2. 分型：根据临床表现分为3型：(1)经典型：生后一周内发病，出现喂养困难、呕吐、嗜睡，随后肌张力增高或降低，可进展为昏迷。(2)轻型：症状较经典型轻，症状持续。尿有异味，神经系统症状常不明显，多数在婴儿期至学龄期前出现智能落后。(3)间歇型：生后无症状，通常在6月～2岁时发病。根据对维生素B1的治疗效果分为2型：（1）VitB1有效型，患者对大剂量VitB1(200～400mg/d)治疗后，患儿的临床症状明显改善，血亮氨酸及缬氨酸水平大于30%；（2）VitB1无效型，患者对大剂量VitB1治疗后血亮氨酸及缬氨酸小于30%。三、治疗1．经典型患者治疗：急性期限制天然蛋白质摄入，每日小于1.5g/kg，同时给予特殊营养粉(不含缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸)治疗，每日总蛋白量2．0～3.0g/kg，左旋肉碱：100～300mg/(kg.d)，静滴或口服。2．VitB1有效型患者治疗：大剂量VitB1治疗，剂量200～300mg/(Kg.d)，分3次口服。四、统计方法使用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以中位数（下限~上限）表示，采用秩和检验对数据进行分析，P﹤0.05为差异有统计学意义。结 果一、临床资料12例患者发病年龄出生后2～30天，经典型10例，其中维生素B1有效型2例。主要表现为喂养困难、反应能力差、体重不增、嗜睡、抽搐、尿异味等；实验室检查出现不同程度的酸中毒(pH:7.24～7.29，碱剩余-12.0～-19.3mmol/L)，乳酸及血氨正常。4例行头颅MRI检查发现脑发育不良、脑室三角区白质信号异常、脑水肿等。经治疗后临床明显好转，精神恢复正常，抽搐消失，异常生化指标改善。二、经典型患者治疗前后血亮氨酸、缬氨酸水平变化 见表1。患者治疗后与治疗前比较，亮氨酸及缬氨酸水平均下降，差异显著，亮氨酸水平仍高于参考值，缬氨酸降至正常。三、经典型患者治疗前后尿支链α-酮酸水平变化 见表2。患者治疗后尿中各支链α-酮酸均有不同程度下降，但仍高于正常参考值，治疗前后差异不显著。四、维生素B1有效型患者治疗前后血、尿检测结果变化 2例患者治疗前血亮氨酸及缬氨酸水平分别为（2696.5、1183.2mmol/L）及（1028.8、795.3mmol/L），治疗后降至正常，分别为（93.6、185.8mmol/L）及（96.9、165.6mmol/L）。尿中支链α-酮酸明显下降，基本降至正常。四、随访结果12例MSUD患者中4例死亡，包括3例经典型患者和1例维生素B1有效型患者。存活8例随访4月～6年，3例定期随访，疗效较好，其中1例发育基本正常，智测评分97分；另外2例智测评分分别为82和76。余5例间断治疗，1例6岁患者不会说话、走路不稳、智力落后；1例1岁患者Gesell评分＜60分；另3例患者未进行智力测试，患者均出现语言表达障碍、智力落后。讨 论MSUD的临床表现缺乏特异性，通过常规实验室检查诊断较困难。患者血浆中亮氨酸水平明显增高，异亮氨酸及缬氨酸水平可升高或正常。可通过串联质谱检测血氨基酸水平及相关氨基酸之间的比值快速诊断此病[2]。叶军等[3]报道国内首例串联质谱方法筛查发现的MSUD患儿。此病患者体内过多的支链α-酮酸可由尿液排出，故可利用气相色谱-质谱检测尿支链α-酮酸水平诊断此病。韩连书等[4]报道利用串联质谱联合气相色谱-质谱技术检测诊断14例MSUD患者。本组有8例患者在新生儿期即通过血串联质谱检测得以诊断。临床工作中，若发现有患者新生儿期出现嗜睡、喂养困难，并出现惊厥、肌张力增高等神经系统症状等，需要考虑到MSUD的可能性，及早进行血串联质谱及尿气相色谱质谱检测，以便早诊断、早治疗。MSUD的治疗原则是以限制天然蛋白质摄入、同时给予配方营养粉(不含缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸)治疗，需额外补充缬氨酸以降低体内亮氨酸水平，减轻脑损伤[5]；对于维生素B1有效型患者需要给予大剂量维生素B1口服。本组治疗结果显示，快速诊断后及时治疗，患者临床症状显著缓解。血中亮氨酸水平较治疗前显著下降，尿中各支链α-酮酸水平较治疗前降低，差异不显著，可能与病例数较少有关。部分患者尽管严格按照上述治疗原则治疗，但是由于氧化应激反应对神经系统的慢性损伤，仍不可避免出现脑损伤后遗症，甚至死亡[6]。近几年有研究尝试肝移植治疗此病。Skvorak等[7]利用MSUD动物模型通过肝细胞移植，对神经系统症状改善有一定作用。Kitchens及Popescu等[8,9]对MSUD患者进行肝移植后发现，不限制蛋白质摄入，支链氨基酸可维持在正常范围内，但神经系统症状未见好转。MSUD患者的预后与发病年龄、临床分型、治疗和家长重视程度密切相关。患者多在新生儿期发病，病情危重，早期诊断、早期治疗对预后至关重要。