杨楠  韩连书  叶军  邱文娟  张惠文  龚珠文  张雅芬  王瑜  顾学范上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书

酪氨酸血症I型(Tyrosinemia  type  1， OMIM 276700)属于常染色体隐性遗传病，是由于肝、肾组织中酪氨酸代谢的终末酶延胡索酰乙酰乙酸水解酶（Fumarylacetoacetase，FAH)缺陷，导致酪氨酸代障碍所致的一种遗传代谢病，又称肝肾型酪氨酸血症，本病患病率约为1/2 000至1/100 000[1]。多数患儿为急性型，起病于新生儿或婴儿期，以肝脏受累显著。少数为晚发型，患儿通常起病于1岁以后，以生长发育迟缓、进行性肝硬化、肾小管功能受损、低磷性佝偻病等为主要表现[1]。延胡索酰乙酰乙酸水解酶由FAH基因编码，FAH基因突变可引起延胡索酰乙酰乙酸水解酶活性降低或丧失。迄今为止有关FAH基因突变的报道已有40余种，我国酪氨酸血症I型的报道多为临床病例 [2-3]，基因突变的研究尚未见报道。本研究对3例酪氨酸血症I型患者进行FAH基因突变分析，现报道如下。

1  对象和方法

1.1 对象  确诊的酪氨酸血症I型患者患儿3例，男2例，女1例，年龄分别为2个月、 6个月及1岁。所有检查均获得患儿家长或监护人的知情同意。

1.2 方法

1.2.1  诊断：临床诊断主要依据（1）肝肿大，伴或不伴黄疸，甲胎蛋白显著增高；（2）串联质谱检测患儿血中酪氨酸(Tyrosine, Tyr)和酪氨酸与苯丙氨酸 (Phenylalanine, Phe)比值增高[2,4]；（3）串联质谱检测血或气相质谱检测尿琥珀酰丙酮升高[5]。

1.2.2  PCR扩增及DNA测序分析：取患儿及父母外周静脉血，分离白细胞，提取DNA。根据参考文献[6]设计引物，覆盖FAH基因全部14个外显子。测序结果结合Genomes(NM_000137) 人类FAH基因序列来识别患儿中的突变。

1.2.3  对未报道突变进行直接测序鉴定分析，并对比100例正常对照者测序结果以排除多态性。

2   结果

2.1  患儿临床资料及辅助检查结果

例1于1月内起病，主要表现为肝肿大、阴囊反复水肿、贫血，肝脏CT未发现结节。例2于5月内起病，主要表现为肝肿大、脾脏增大、腹泻、喂养困难、运动发育落后，实验室检查：凝血时间：31.7s，部分凝血酶原时间：110.1s，腹部B超示肝肿大（肝硬化）。例3于1岁内起病，主要表现为肝肿大、腹胀，肝脏B超提示肝硬化伴结节。3例患者肝功能、血串联质谱结果和尿气相色谱-质谱结果见表1。例2和例3使用尼替西农联用低酪氨酸饮食治疗后，肝脏明显缩小，AFP下降。

表1    3例酪氨酸血症-I型患者临床表现、临床检测结果和基因检测结果

患者

检测指标（参考值）

P1

P2

P3

肝肿大

肋下3.5cm

肋下3cm

肋下4cm

肝硬化

无

有

有，伴结节

水肿

有

无

无

贫血

有

无

无

酪氨酸(20～100mmol/L)

324.57

295.72

297.44

苯丙氨酸(20～120mmol/L)

106.20

56.47

60.93

Tyr/Phe(0.5～2.0)

3.00

5.20

4.97

琥珀酰丙酮(1～5.0mmol/L)

10.70

9.50

13.40

甲胎蛋白(0~25ng/mL)

>35350

>121000

408

谷丙转氨酶(10~42U/L)

50

153

7

谷草转氨酶(0~75U/L)

72

33

44

碱性磷酸酶(34~114U/L)

2020

1250

1875

尿琥珀酰丙酮SUAC(0)a

165.62

0.00

110.10

尿4-羟基苯乙酸(8～75)a

354.42

173.80

192.70

尿4-羟基苯乳酸(0～7.0)a

1504.81

881.00

2245.90

尿4-羟基苯丙酮酸(0～1.0)a

1275.02

469.90

176.40

基因检测结果

突变1

c.520C>T(R174X)

c.455G>A(W152X)

c.520C>T(R174X)

突变2

c.1100 G>A(W367X)

c.1027G>A(G343R)

c.974_976delCGAinsGC

注：a结果为尿气相质谱检测的离子强度分别与17烷酸离子强度的比值。

2.2  FAH基因突变检测结果 3例患儿各检测到2个突变，共5种突变，其中P1患者检测到c.520C>T(R174X)及c.1100 G>A(W367X)突变（见图1），其母亲检测到c.520C>T(R174X)突变，其父检测到c.1100 G>A(W367X)突变；P2患者检测到c.455G>A(W152X)及c.1027 G>A(G343R) （见图2），其父亲检测到c.455G>A(W152X)，其母亲检测到c.1027 G>A(G343R)；P3患者检测到c.520C>T(R174X)及c.974-976delCGAinsGC突变（见图3），其父亲检测到c.520C>T(R174X)，其母亲检测到c.974_976delCGAinsGC突变。这些突变经反向测序得到同样结果。c.520C>T(R174X)及c.1027 G>A(G343R)为已报道突变，c.455G>A(W152X)、c.974_976delCGAinsGC及c.1100 G>A(W367X)为新突变。

1a 1b

1c 1d

图1  P1患者FAH基因突变位点测序图

注：1a:P1患者FAH基因c.520C>T突变；1b：FAH基因cDNA序列520位点正常对照；1c：P1患者FAH基因c.1100 G>A；1d：FAH基因cDNA序列1100位点正常对照

2a 2b

2c 2d

图2  P2患者FAH基因突变位点测序图

注：2a：P2患者FAH基因c.455G>A突变；2b：FAH基因cDNA序列455位点正常对照；3c：P2患者FAH基因c.1027 G>A突变；3d：FAH基因cDNA序列1027位点正常对照

3a 3b

3c 3d

图3  P3患者FAH基因突变位点测序图

注： 3a: P3患者FAH基因c.520C>T突变；3b：FAH基因cDNA序列520位点正常对照；3c：P3患者FAH基因c.974-976delCGAinsGC；3d：FAH基因cDNA序列974-976位点正常对照

2.3  基因型与临床表型的关系   根据发病年龄，临床将酪氨酸血症I型分为急性型(发病年龄<6个月)、亚急性型(发病年龄6个月～2岁)及慢性型(发病年龄>2岁)[7]。急性型患者主要表现为：出生后数日内出现严重的肝功能损害、黄疸等，少数重症病例死亡；亚急性型患者在婴幼儿期发病，出现、肝大、肝功能不全喂养困难等；慢性型患者发病较晚，多在幼儿期发病，多以肾病症状为主要表现。本研究中，患儿P1和P2属于急性型，主要临床表现为肝脾肿大、腹泻、水肿、贫血等，患儿P3属于亚急性型，表现为肝肿大。基因型与临床表型如表1所示。

3 讨论

酪氨酸血症I型以婴幼儿早期肝功能损害为主要临床表现，后期可出现生长发育迟缓和佝偻病的表现。未治疗的婴幼儿可表现为神经危象，急性型患者可死于肝功能衰竭。故早期诊断及治疗，对本病的预后起着至关重要的作用。由于此病缺乏特异性的临床表现，常规实验室检测如AFP显著增高、肝功能异常、血酪氨酸增高等，与其他引起肝脏损害和血酪氨酸增高的疾病如半乳糖血症、Citrin蛋白缺乏症等较难鉴别[8]。近10余年随着串联质谱和气相质谱的应用，血或尿琥珀酰丙酮水平增高作为诊断酪氨酸血症I型的关键指标已经逐步得到认可。本研究室利用串联质谱检测11例酪氨酸血症I型患儿血琥珀酰丙酮均升高，气相质谱检测的7例患儿的尿琥珀酰丙酮，仅4例增高[9] 。Peters等[10]研究也证实酪氨酸血症I型患者尿气相质谱检测琥珀酰丙酮可阴性，说明串联质谱联检测血琥珀酰丙酮作为诊断酪氨酸血症I型的指标更可靠。

酪氨酸血症I型主要治疗方法是控制天然蛋白质摄入、给予不含苯丙氨酸、酪氨酸配方营养粉饮食治疗及尼替西农（nitisinone）药物治疗。天然蛋白质摄入量需控制在1～1.5g/Kg.d，不含苯丙氨酸、酪氨酸配方营养粉用量为1.5～2.0/Kg.d。尼替西农初始剂量为1mg/Kg.d，分2～3次口服。尼替西农是一种4-羟基苯丙酮酸二氧化酶抑制剂，可抑制酪氨酸转变为4-羟苯丙酮酸，对此病引起的肝脏、肾脏及心脏功能损害均有显著的效果[11,12]。本研究中3例患者，1例未进行治疗，目前生长发育迟滞；另外2例患者经过半年的配方营养粉及尼替西龙联合治疗，肝脏分别由3.5cm和4cm缩小至2cm和3cm，胆汁酸、碱性磷酸酶、g－谷氨酰转肽酶及甲胎蛋白均显著下降，血和尿琥珀酰丙酮降至正常，血酪氨酸水平轻度下降[13]。

酪氨酸血症I型是由于编码延胡索酰乙酰乙酸水解酶的FAH基因突变所致，至今有关FAH基因突变已经报道40余种，不同的种族存在不同的热点突变。Elpeleg等[14]报道以色列Ashkenazi Jewish族患者3例均为P261L突变，Moslem-Palestinian族患者10例中8例为IVS8 –1G>C/IVS8 –1G>C突变。Poudrier等[15]报道法裔加拿大人群中，87.9%患者携带c.1062+5G>A突变，魁北克新生儿筛查发现此突变携带率高达1：66。Faiqa等[16]报道中东地区43例患者携带17种突变，其中R237X为热点突变。韩国有1例大片段缺失(外显12-14)的报道[17]。中国尚无此病的基因突变报道。本研究中在3例患者中发现5种突变，分别为：W152X、R174X、G343R、W367X和c.974_976delCGAinsGC。患儿P1基因型为c.520C>T/c.1100 G>A， 即携带R174X和W367X两个无义突变，R174X于1996年报道[18]，发现1例波兰患者携带该突变，临床表型不详。R174X和W367X均为无义突变，其编码产物为截短蛋白，产物在体内降解而严重影响酶活性。本研究中，患儿P1于1月龄内发病，为急性型，主要表现为肝肿大、水肿、贫血。患儿P2基因型为c.455G>A/c.1027 G>A，即携带W152X和G343R突变，其中G343R于2011年报道[16]，见于3例中东地区患者。G343位点位于高度保守区，在酶活化位点附近，该位点G343R突变可显著影响酶活性[19]。W152X为无义突变，其编码产物为截短蛋白，产物在体内降解而严重影响酶活性。患儿P2于5月龄内发病，为急性型，主要表现为肝肿大、肝硬化、腹泻、出血。患儿P3基因型为c.520C>T/ c.974_976delCGAinsGC，即携带R174X 和c.974_976delCGAinsGC突变。c.974_976delCGAinsGC引起读码框移，在其下游49个密码子出现终止密码子，导致翻译提前终止，突变产物比正常蛋白少47个氨基酸，可影响酶活性。患儿P3于1岁内发病，为亚急性型，主要表现为肝肿大、肝硬化。由于本研究病例数较少，尚不能明确基因型与临床表型的关系。在Rootwelt报道基因型为IVS6-1G>T/IVS6-1G>T的8例患者，5例表现为亚急性型，3例为慢性型[20]；而在北欧和地中海国家报道的病例中，相同的基因型IVS6-1G>T/IVS6-1G>T患者8例，6例表现为急性型，2例表现为慢性型[21]；在Bergman报道的西班牙病例中，13例患者基因型为IVS6-1G>T/IVS6-1G>T，11例表现为急性型，1例表现为亚急性型，1例表现为慢性型[19]。由此可见，尽管患者有着相同的基因型，但是临床表现并不尽相同，还有其他因素可以影响临床表现。类似的情况再其他遗传性代谢病中也有发现，如苯丙酮尿症[22]。对基因型IVS6-1G>T/IVS6-1G>T的患者长期随访发现，患者出现肾钙沉着症的比例显著低于其他基因型的患者，但是出现肝肿大的比例与其他基因型患者相同[23]。

由于本研究病例数较少，尚不能明确基因型与临床表型的关系，基因检测可为患者家庭提供产前诊断，并为进一步的相关研究提供依据。本科室已经开展多种罕见病的基因产前诊断[24,25]。

[1]基金项目：国家高新技术研究发展计划(863计划)（2007AA02Z447）；上海市卫生局重大课题（2008ZD001）；上海市卫生局科研课题(2009210); 上海市科委重大课题（11dz1950300）

作者单位：200092 上海交通大学医学院附属新华医院,上海市儿科医学研究所,内分泌、遗传代谢病研究室