摘要：目的  观察FasL基因关节腔内转染对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞的凋亡诱导作用。 方法  SD大鼠分为正常转染对照组、正常转染组、模型转染对照组、模型转染组。向模型转染对照组、模型转染组动物右后足趾皮内注射0．1ml弗氏完全佐剂致炎，诱导佐剂性关节炎。观察大鼠关节炎指数，大鼠滑膜细胞增生、炎性细胞浸润情况，TUNEL检测滑膜细胞凋亡水平。 结果  模型转染组与模型转染对照组比较显著降低大鼠关节炎指数(AI)，差异有统计学意义（p〈0.05, p〈0.01〉；模型转染对照组、正常转染组与正常转染对照组比较，大鼠滑膜细胞凋亡指数差异无统计学意义（p>0.05〉, 模型转染组与正常转染对照组、模型转染对照组比较差异有统计学意义（p〈0.01〉。结论  FasL基因关节腔内转染可诱导佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡，降低佐剂性关节炎大鼠的关节炎指数。上海交通大学医学院附属第九人民医院北部院区风湿免疫科赵福涛

关键词： FasL 基因 ；关节炎， 类风湿；滑膜细胞；凋亡

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜为主要靶组织的慢性系统性炎症性的自身免疫性疾病，主要病理改变为关节滑膜细胞增生、炎症细胞浸润、滑膜翳形成、软骨和骨组织的侵蚀和破坏，最终导致关节结构的破坏和功能障碍。RA致残率高，严重影响患者生活质量。鉴于RA最显著的特点是以滑膜为靶目标的炎症反应和损伤，我们以佐剂性关节炎大鼠为模型向其关节腔内直接注射携带FasL基因的腺病毒，使滑膜高表达FasL，观察FasL基因诱导关节滑膜细胞凋亡的作用。

1  材料与方法

1.1 实验动物  清洁级SD大鼠50只，雄性，体质量(180±20)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2007-0005，饲养于上海交通大学附属医学院第三人民医院SPF级动物房。

1.2 仪器试剂  OLYMPUS ZX2荧光倒置显微镜，弗氏完全佐（10mg/L，Chondrex公司生产，货号7027），细胞凋亡原位检测试剂盒（上海劢瑞生物科技有限公司，货号QIA33），Ad－FasL、Ad－LacZ （上海第二军医大学免疫实验室提供）。

1.3 方法   SD大鼠于购买后在动物房饲养1周，以适应环境。给予30只SD大鼠右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂0.1 ml致炎[1]，制成AA模型。结果造模成功20只。20只AA模型大鼠随机分2组：模型转染对照组、模型转染组各10只。20只健康SD大鼠随机分为正常转染对照组、正常转染组。共4组。造模后第11天, 正常转染对照组、正常转染组、模型转染对照组、模型转染组分别给以关节腔内注射Ad－LacZ、Ad－FasL、Ad－LacZ、Ad－FasL各0.01ml(病毒量1011/ml)。

1.4 观察指标

1.4.1  关节炎指数(arthritis index,AI)评定：致炎后第11天、15天、19天、23天开始观察并记录全身关节病变程度。全身病变按5级评分法评价：0级：无红肿；1级：小趾关节稍肿；2级：趾关节和趾跖肿胀；3级：踝关节以下的足爪肿胀；4级：包括踝关节在内全部足爪肿胀。根据其余3只未注射佐剂的肢体病变程度累计积分，计算出每只大鼠的AI。

1.4.2  关节滑膜病理HE染色  免疫后第23天腹腔麻醉，脱臼处死大鼠，打开膝关节腔取出滑膜，用福尔马林溶液固定，经乙醇脱水，常规石蜡包埋，4um切片，行苏木精-伊红（HE）染色，显微镜下观察滑膜的病理改变情况。

1.4.3  滑膜细胞凋亡检测（TUNEL） 石蜡切片后按凋亡试剂盒说明书进行滑膜细胞凋亡检测。每张玻片取5个视野，于荧光倒置显微镜下选择200个细胞，计数阳性细胞数得出滑膜细胞凋亡率。

1.5  统计学处理：应用SPSS13.0统计处理，数据以均数士标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，p<0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1  一般情况  模型组大鼠在注射完全佐剂半小时后出现炎性肿胀，第4天炎性肿胀减轻。第11天出现关节对称性肿胀，大鼠毛发稀疏、缺乏光泽，活动减少。体重变化见下表1：实验前各组动物体重差异无统计学意义，（p>0.05）即实验前大鼠的体重在各组间较为均衡；实验后模型组体重较正常转染对照组降低（p<0.01），模型转染组体重明显高于模型转染对照组（p<0.01）。

2.2  AI评定  致炎后第11天模型转染组与模型转染对照组比较，差异无统计学意义(p>0.05)；致炎后第15天、19天、23天模型转染组与模型转染对照组比较，差异均有统计学意义（(p<0.05, p<0.01)），即AI均下降。

2.3  HE病理染色形态学观察  正常转染对照组滑膜结构清楚，滑膜1-2层，无炎性细胞浸润；正常转染组滑膜结构清楚，滑膜1-2层，滑膜内无炎性细胞浸润；模型转染对照组滑膜细胞增生，可达7-8层，有炎性细胞浸润；模型转染组滑膜层细胞增生，可达3-4层，有少量炎性细胞浸润。提示FasL基因转染可减少滑膜细胞增生，减轻炎症。

2.4  TUNEI法检测滑膜细胞凋亡结果：模型转染对照组凋亡指数与正常转染对照组、正常转染组比较差异无统计学意义（P>0.05）；模型转染组与正常转染对照组、正常转染组、模型转染对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，即可诱导大鼠佐剂性关节炎滑膜细胞凋亡。

3讨 论

Fas配体（Fas Ligand，FasL）即CD178，属于肿瘤坏死因子家族成员，是相对分子质量为4OKD的Ⅱ型跨膜蛋白，主要分布于活化的T淋巴细胞以及眼、睾、脑和脊髓等免疫豁免组织。FasL能特异性地与靶细胞膜上的Fas结合，诱导靶细胞凋亡。Fas即CD95，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，是相对分子质量为45KD的I型跨膜蛋白。人Fas在转录过程中通过不同拼接产生可溶性sFas，由于其缺乏跨膜蛋白，故与Fasl结合后可抑制凋亡。Fas可表达于体内多种细胞，如活化T、B淋巴细胞、单核细胞、NK 细胞、成纤维细胞等。FasL/Fas系统介导的细胞凋亡在T、B淋巴细胞的分化发育、成熟及人体自身免疫耐受机制中起到重要的作用。FasL/Fas系统亦参与肿瘤、自身免疫性疾病等免疫病理过程。

RA是一种以关节进行性破坏为特征的常见自身免疫性疾病。目前认为RA在抗原刺激下，导致机体免疫紊乱，自身反应性T细胞被激活而释放大量细胞因子，引起关节滑膜细胞过度增殖。Asahara H等研究发现RA患者约30％～90％滑膜细胞高表达Fas，而FasL mRNA仅在RA滑膜组织单个核细胞中被检测到,因此RA患者滑膜细胞FasL/Fas凋亡系统异常，导致滑膜细胞增殖与凋亡失衡。国内学者以质粒为载体，将FasL基因转染原代培养的RA患者滑膜细胞，结果FasL基因可诱导体外培养的RA滑膜细胞问的凋亡增加。 Zhang H等将携带FasL 基因的腺病毒多次重复注入移植到免疫缺陷小鼠皮下的人RA滑膜组织中，发现滑膜细胞凋亡指数较对照组显著增加，且移植滑膜组织体积缩小，重量下降。本实验采用关节腔内转染FasL基因观察其对大鼠佐剂性关节炎滑膜细胞凋亡的影响，结果与Zhang H等相似。本研究发现直接将携带FasL基因的腺病毒注射到佐剂性关节炎大鼠关节腔内可诱导滑膜细胞凋亡并且减轻了滑膜组织炎症降低了AI。

RA病程迁延，反复发作，目前尚无特效药物治疗，临床上主要应用非甾体抗炎药和改善病情的药物。此类药物虽能改善病情，但不良反应较多。近年来，针对炎性细胞因子已开发出许多生物制剂（如类克、恩利等），各种生物制剂应用前景广阔，但生物制剂治疗RA有以下共同缺点，生物制剂口服易被胃蛋白酶消化,注射后因生物半衰期较短，达不到所需血药浓度；作用靶器官无选择性等缺点而且高剂量应用增加各种感染风险。国外报道加用依那西普治疗重症RA患者可诱发或加重原有肺间质病变。本研究以腺病毒为载体将FasL基因直接转染AA大鼠关节腔内，显著提高了滑膜细胞的凋亡率，为RA的临床治疗提供了重要的理论依据。近年来随着DNA重组技术和基因转移技术的不断进步，基因治疗RA成为极有发展前景的治疗方法。

[1] 基金项目：上海市教育委员会科研项目（06BZ045）

作者单位：201900上海交通大学医学院附属第三人民医院风湿免疫科