中华儿科杂志，2005,43(5):325-330

韩连书，高晓岚，叶军，邱文娟，顾学范

[摘要]  目的  应用串联质谱技术通过检测干血滤纸片中的酰基肉碱谱，对遗传性代谢病高危儿童进行有机酸血症筛查和诊断研究。 方法  遗传性代谢病高危儿童1000例，男642例，女358例，年龄中位数为2岁(5天～15岁), 手指采血，滴于滤纸片上。取直径为3 mm的干血滤纸片放入96孔聚丙烯板，经含酰基肉碱内标的甲醇萃取，盐酸正丁醇衍生后，进行串联质谱分析。结果  在1000例高危儿童中筛查并诊断有机酸血症40例(4.0%)，其中甲基丙二酸血症20例，丙酸血症6例，异戊酸血症3例，戊二酸血症I型3例，戊二酸血症II型3例，3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症1例，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症1例，生物素酶缺乏症2例，b-酮硫解酶缺乏症1例。患者临床表现主要为运动和智力发育落后、抽搐、意识障碍、肌张力低下、呕吐和喂养困难等。常规实验室检查主要表现为酸中毒、高血氨、高乳酸血症和低血糖等。结论  串联质谱技术能够通过检测血滤纸片中的不同酰基肉碱浓度，对部分有机酸血症进行快速筛查和诊断，结合尿气相色谱/质谱技术，有助于提高有机酸血症诊断的准确性。上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书

【关键词】 串联质谱；有机酸血症；酰基肉碱；遗传性代谢病

Application of Tandem Mass Spectrometry in diagnosis of organic acidemias  HAN Lian-shu, GAO Xiao-lan, YE Jun, QIU Wen-jun, GU Xue-fan. Department of Pediatric Endocrinology, Genetic and Metabolism, Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai Institute for Pediatric Research, Shanghai 200092, China

   [Abstract]  Objective The diagnosis of organic acidemias is very difficult and need special test methods. Recently the tandem mass spectrometry had been used in screening and diagnosis of the inborn error of metabolism. The aim of the present study was to utilize a dry blood filter paper method for acylcarnitines profiles test using tandem mass spectrometry in diagnosis of organic acidemias in high risk children. Method  One thousand patients (642 were males and 358 females) with high risk of inborn error of metabolism were studied, The median of their age is 2 years. The blood was collected on filter paper, punched and extracted into methanol solution with stable isotope labeled internal standards of acylcanitine, then derivatized with butanolic-HCI. After preparation, the samples were analyzed by tandem mass spectrometry. The volume of the acylcanitines was calculated by the special software. Results Forty patients (4.0%) were diagnosed as organic acidemias among the 1000 patients, including 20 methylmalonic acidemia, 6 propionic acidemia, 3 isovaleric acidemia，3 glutaric acidemia type I, 3 glutaric acidemia type II, 2 biotinidas deficiency, 1 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency，1 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase deficiency, and 1 beta-keto thiolase deficiency. The common clinical symptoms and signs of these patients were developmental and mental retardation, spasm, lethargy, coma, hypotonia, vomiting, and feeding difficult. Routine laboratory tests were suggested by metabolic acidosis, hyperammonemia, hyperlactonemia, hypoglycemia, anemia liver function abnormal.  Conclusion  An apart of organic acidemias can be fast diagnosed by tandem mass spectrometry through acylcarnitine profiles analysis in dry blood filter paper. The fast and accurate diagnosis of organic acidemias by tandem mass spectrometry will be rise by combine the gas chromatography mass spectrometry.

 [Key words]   tandem mass spectrometry; organic acidemias; acylcarnitine; inborn error of metabolism

有机酸血症主要是由于氨基酸、脂肪酸和糖代谢异常导致中间代谢产物－有机酸增加，而引起一系列病理生理改变和临床症状的一组疾病，由于患者尿中含有大量有机酸又称为有机酸尿症。我国以往由于检查条件的限制，有机酸血症诊断较困难，许多患者不能得到及早的诊断和治疗。气相色谱/质谱技术为有机酸尿症的诊断提供了条件。近几年发展的串联质谱新技术，通过快速检测血中酰基肉碱谱，为有机酸血症的筛查和诊断提供了新方法[1,2]。我们在国内率先开展串联质谱新技术进行遗传性代谢病的筛查和诊断[3]，现报告2003年1月～2004年10月1000例临床高危儿童有机酸血症筛查的结果和体会。

对象与方法

一、对象

临床疑似遗传性代谢病高危儿童1000例，分别来自上海、北京、广州、香港、澳门等全国20余个省、市、特区的55所医院，其中男642例，女358例，年龄中位数为2岁(5天～15岁)。健康儿童780例，来自托儿所和幼儿园，男489例，女291例，平均年龄7岁。通过检测健康儿童的血酰基肉碱水平确定本实验室的正常上限值。所有检测均取得家长的知情同意。

高危儿童临床表现包括反复呕吐、抽搐、昏迷或嗜睡、智力运动发育落后、生长发育迟缓、肌张力异常和肝脾肿大等，常规实验室检查提示有代谢性酸中毒、低血糖、高血氨、高乳酸血症等，均是原因不明者。标本采集用干血滤纸片法，手指采血或静脉抽血，滴于专用采血滤纸(S&S 903#)上，晾干后送检。

二、试剂、材料和仪器

1. 试剂：甲醇、盐酸正丁醇(3 mol/L)、乙腈和氮气。盐酸正丁醇(3 mol/L)由正丁醇和乙酰氯按9:1(v:v)配制。同位素内标：选用8种酰基肉碱的同位素内标对样品中20余种酰基肉碱进行定量，所有内标均购自美国剑桥同位素实验室，包括2H9-游离肉碱(2H9-carnitine, 2H9-C0)，2H3-乙酰肉碱（2H3-acetylcarnitine，2H3-C2），2H3-丙酰肉碱（2H3-propionylcarnitine，2H3-C3），2H3-丁酰肉碱（2H3-butyrylcarnitine，2H3-C4），2H9-异戊酰肉碱（2H9-isovalerylcarnitine，2H9-C5），2H3-辛酰肉碱（2H3-octanoylcarnitine，2H3-C8），2H9-肉豆蔻酰肉碱（2H9-myristoylcarnitine，2H9-C14），2H3-棕榈酰肉碱（2H3-palmitoylcarnitine，2H3-C16）。上述同位素内标用甲醇稀释成工作液，4°C冰箱保存，1个月内用完。

2. 材料：96孔聚丙烯板，96孔过滤板(滤膜孔径0.45 mm)购自Millipore公司。

3. 仪器：串联质谱仪(API 2000型)购自美国生物应用系统公司(Applied Biosysterms)，高效液相仪采用美国安捷仑公司(Agilent 1100)产品。

三、测定方法

1．样品处理：参考 [3, 4]报道的方法，取直径3 mm的干滤纸血片(相当于3.2 ml全血)，置于96孔过滤板中，每孔加入含酰基肉碱内标的甲醇溶液100 ml，室温放置20 min，萃取血片中的酰基肉碱，然后离心至另一个96孔聚丙烯板，50°C加热吹干，再加入60 ml盐酸正丁醇(3 mol/L)，Teflon 膜覆盖，置65°C恒温箱内15 min，随后50°C加热吹干，再加入80％乙腈100 ml溶解，铝膜覆盖，即可上样检测。

2．仪器设置  流动相采用80％乙腈，四元泵流速设置为30 ml/min，自动进样器设置为每次进样20 ml。酰基肉碱测定采用母离子扫描方式，子离子质荷比(m/z)为 85，扫描范围为m/z 210～m/z 502，一个样品测试约需时间2.5 min。

3．资料分析  定量分析采用软件ChemoView 1.2版本 (美国应用生物系统公司)，根据各种丁酯化的同位素内标和酰基肉碱的离子峰强度，由已知浓度的内标，自动计算出所测样品中酰基肉碱的浓度。质控样品采用美国疾病控制和预防中心（CDC）新生儿筛查质控部门提供的串联质谱酰基肉碱血滤纸片。

四、有机酸血症的诊断

有机酸血症患者在有机酸代谢途经发生障碍时导致其中间代谢产物增加，包括不同种类的酰基肉碱增高。各型有机酸血症的诊断依据串联质谱特异性酰基肉碱谱的改变，结合尿气相色谱/质谱有机酸分析、临床表现和常规实验室检查等确定。

结    果

一、筛查结果

在1000例高危儿童中确诊有机酸血症40例（4%），见表1。其中甲基丙二酸血症(Methylmalonic Acidemias，MMA)最多(50%)，其次为丙酸血症(Propionic Acidemia，PA，15%)、异戊酸血症((Isovaleric Acidemia，IVA, 7.5%)、戊二酸血症(Glutaric Acidemia，GA)I型和II型(各7.5%)、生物素酶缺乏症(5%)、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症(3-Methyl Crotonyl-CoA Carboxylase Deficiency, 3-MCC)、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症(3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoA Lyase Deficiency, 3-HMC)及b-酮硫解酶缺乏症各1例。表1列出了不同有机酸血症对应的串联质谱检测参数（不同种类的酰基肉碱），以及这些参数的正常儿童上限值和患儿的检测值。

表1  高危儿童有机酸血症串联质谱筛查结果

疾病                                                                n        异常标志           浓度            正常上限值

                                                                      (％)      (mmol/L)        (mmol/L)         (mmol/L)

甲基丙二酸血症                                          20(50)          C3               11.24                  5.00

                                                                                    C3/C0              0.58                   0.20

                                                                                    C3/C2              1.34                   0.30

丙酸血症                                                       6(15)          C3               39.84                  5.00

                                                                                    C3/C0              1.20                   0.20

                                                                                    C3/C2              2.23                   0.30

异戊酸血症                                                  3(7.5)          C5                2.53                   0.40

戊二酸血症1型                                           3(7.5)        C5DC              2.14                   0.15

戊二酸血症2型                                           3(7.5)       多种酰基肉碱增高

3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症                1(2.5)       C5-OH             2.42                   0.60

3-羟-3-甲基戊烯二酰辅酶A裂解酶缺乏症    1(2.5)       C5-OH             3.79                   0.60

生物素酶缺乏症                                           2(5.0)          C3                8.75                   5.00

                                                                                    C3/C0              0.18                   0.20

                                                                                    C3/C2              0.31                   0.30

                                                                                   C5-OH             5.50                   0.70

b-酮硫解酶缺乏症                                        1(2.5)       C5-OH             2.31                   0.70

                                                                                     C5:1               0.63                   0.05

注：C3为丙酰肉碱，C5为异戊酰肉碱，C5DC为戊二酰肉碱，C5-OH为3-羟基异戊酰肉碱，C5:1为异戊烯酰肉碱

从表中可以看出患儿的检测值高于正常上限值数倍，甚至10余倍。MMA和PA患者均为丙酰肉碱(Propionylcarnitine，C3)增高，两者比较丙酸血症增高更显著(t=6.110, P<0.001)。另外，pa患者血甘氨酸(glycine，gly)增高(614< font="">±220)mmol/L(正常上限值<400 mmol/L)，MMA患者Gly平均浓度在正常范围（243±123）mmol/L，两者比较差异显著(t=5.231, P<0.001)。生物素酶缺乏症表现为c3和3-羟基异戊酰肉碱（3-hydroxyisovlerylcartine，c5-oh）增高，以5-oh增高显著。3-mcc和3-hmg均为c5-oh增高。< font="">

正常儿童和PA、MMA、IVA、GAI患儿的串联质谱图见图1，不同疾病相对应参数的离子峰强度显著增高，与定量结果一致，PA和MMA均表现C3离子峰强度增高，PA患儿C3增高更显著。

二、临床资料分析

40例有机酸血症儿童中男23例，女17例，年龄20天～15岁，发病年龄1天～15岁，诊断年龄1个月～15岁，发病至诊断明确间隔时间23天～11年。其中34例患儿临床资料较完整，智力落后14例(41.2%)，抽搐10例(29.4%)，意识障碍（嗜睡或昏迷）11例(32.4%)，运动落后22例(64.7%)，肌张力低下14例(41.2%)，步态不稳3例(8.8%)，呕吐13例(38.2%)，喂养困难2例(5.9％)，肝脾肿大2例(5.9%)，肌肉疼痛1例(2.9%)。家族史阳性3例（8.8％），其中2例MMA患儿的姐姐已明确诊断为MMA，1例MMA患儿的同胞中有不明原因的夭折史。常规实验室检查显示高乳酸血症17例（50％）, 酸中毒11例(32.4％), 尿酮体阳性8例(23.5%)，高血氨7例(20.6%)，肝功能异常6例(17.6%)，贫血5例(14.7%)，肌酸激酶增高5例(14.7%)，低血糖4例(11.8%)，头颅CT或核磁共振检查异常8例(23.5%)，表现为不同形式的脑损害。

                        讨    论

有机酸是氨基酸、脂肪酸、类固醇、碳水化合物或者某些药物在体内代谢的中间产物，由于代谢途经中某种酶的缺陷，导致其中间代谢产物和旁路代谢产物的增加，形成有机酸血症。在代谢过程中大部分有机酸需与辅酶A结合成酰基辅酶A才能逐步代谢，有机酸血症时同时导致大量酰基辅酶A的累积，酰基辅酶A与肉碱结合形成酰基肉碱，辅助有机酸的排出，所以患者体内相对应的酰基肉碱大量增加[5]。由于血中酰基肉碱属微量物质，结合其结构的特点，常规的实验室方法较难测定。既往有机酸血症的诊断常常依靠培养外周血白细胞或皮肤成纤维细胞酶活性测定，难于广泛应用，目前临床主要采用尿液气相色谱/质谱有机酸分析方法进行诊断。

串联质谱技术将被测物质分子电离成各种质荷比不同的带电粒子，由一级质谱(MS1)选择一定质量的离子进入碰撞室产生子离子或中性分子，再经过二级质谱(MS2)检测，通过母离子与子离子或中性分子配对分析，显著提高了方法的特异性和灵敏性[6]。对于有机酸血症，串联质谱主要通过检测血液中不同的酰基肉碱的浓度进行筛查和诊断。Wilcken等[7]报道澳大利亚利用串联质谱进行新生儿遗传代谢病筛查后有机酸血症患病率较以前显著增加。本研究利用串联质谱技术，在高危儿童中有机酸血症的阳性率为4.0％。与气相色谱/质谱检测遗传性代谢病高危儿童相比较，国内杨艳玲报道阳性率为4.2％[8]，罗小平为3.7%[9]，巴西Wajner报道为4.2％ [10]，串联质谱技术与气相色谱/质谱技术对有机酸的检测阳性率比较接近。病种方面以MMA最多(50％)，其次为PA(15%)，与国内及其他国家结果一致[8, 10, 11]，至于IVA、GA-I和GA-II型等所占比例有所不同，可能与所用检测方法的不同有关。

根据有机酸血症的发病机制，串联质谱技术对于某些有机酸血症可明确诊断，例如， C5显著增高可诊断IVA， C5DC单独增高可诊断GA-I型，多种酰基肉碱增高可诊断GAII型(又称为多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症)，甲基丙二酰肉碱(C4DC)和C3均增高可诊断MMA，C5-OH和C3均增高可诊断多种羧化酶缺乏症。部分有机酸血症串联质谱分析可表现为同一种酰基肉碱增高，如PA和MMA均为C3增高，本研究诊断为MMA的20例高危儿童，C4DC均正常。但根据发病机制由于PA直接引起C3增高，而MMA间接引起C3增高，所以理论上PA时C3增高更显著，这在本研究串联质谱的C3检测结果中得到证实，与Chace等[12]报道的一致。我们观察到C3大于30 mmol/L基本可排除MMA，诊断为PA，小于15 mmol/L基本可排除PA，诊断为MMA，C3介于15～30 mmol/L之间需进行尿有机酸分析进行鉴别。至于MMA患者C4DC不增高的原因可能与甲基丙二酰辅酶A不易与肉碱结合有关。虽然生物素酶缺乏症或多种羧化酶缺乏症也有C3增高，但同时伴有C5-OH增高，且以C5-OH增高为主，C3/C0和C3/C2正常，而MMA和PA 患者C3/C0和C3/C2显著增高，故易与PA或MMA鉴别。对于3-MCC、3-甲基戊烯二酰辅酶A 水解酶缺乏症和3-HMC串联质谱分析均表现为C5-OH增高，且增高的程度无显著差别，故单用串联质谱仅可提示为这三种疾病中的一种，不能确定是哪一种疾病，需要进行尿气相色谱/质谱分析进行鉴别。Koeberl报道[13]利用串联质谱技术在美国北佛罗里达州筛查出的8例C5-OH增高的新生儿，均确诊为3-MCC，表明在这三种疾病中，3-MCC的发病率可能较高。当然，尿液气相色谱/质谱分析对有机酸血症检测有其优点，但不足之处为标本处理成本高，分析时间较长，不适合大规模常规筛查。利用高灵敏、快速的串联质谱分析血酰基肉碱的优点，结合进一步的尿气相色谱/质谱分析，可使有机酸血症的诊断更加快速、准确。

从本文患儿的临床和常规实验室检查结果分析来看，单靠临床症状和常规实验室检查不能够确定有机酸血症，当遇到原因不明的运动、智力发育落后、抽搐、意识障碍和肌张力低下等神经系统表现，或者有呕吐、喂养困难和肝脾肿大等多脏器损害的症状体征，在实验室方面有酸中毒、高血氨、高乳酸血症、低血糖、肝功能异常、贫血和酮症，或者头颅CT、核磁共振表现为不同形式的脑损害时，应考虑到有机酸血症或其他遗传性代谢病的可能，留取血样或尿样送到能够进行酰基肉碱、有机酸和氨基酸分析的实验室进行特异性检测。这样可及早诊断，及早治疗，避免或减轻不可逆的病理改变。本研究中患儿发病时间在1岁之内的占83.3%，而1岁内得到确诊的只占33.3％，明确诊断距发病时间超过1年者达45.8％。说明大部分患儿未能在发病后较短的时间内得到确诊和正确的治疗，导致在明确诊断时已出现不可逆的神经系统发育异常，其中2例患儿因病情已较重，在明确诊断后不久死亡。可见对于高危患儿进行特殊的检查非常重要。

综上所述，串联质谱技术是检测有机酸血症的又一项新技术，该技术还能够同时对多种氨基酸代谢病和脂肪酸氧化障碍进行筛查和诊断，结合其检测速度快的优点，在一些发达国家已广泛应用于新生儿遗传代谢病的筛查，提高了筛查质量，提高了遗传代谢病的诊治水平。本研究为串联质谱技术在国内的应用和推广提供了经验。