商冠宁1，2 吕刚2 孙平1 邢浩1 郑珂1 王玉名1 王巍1

1， 辽宁省肿瘤医院骨软组织肿瘤科，辽宁 沈阳 110042辽宁省肿瘤医院(中国医科大学肿瘤医院)骨软组织肿瘤科商冠宁

2， 中国医科大学附属一院骨科，辽宁 沈阳 110003

 

【摘要】 目的：研究以体外建系的人骨肉瘤MG-63细胞系为模型，研究抗OPN特异性抗体对骨肉瘤高转移细胞系侵袭转移生物学行为的影响。方法：以人骨肉瘤MG-63细胞系为研究对象，抗OPN特异性抗体作用于MG-63细胞系，采用RT- PCR法、Western blot法分别检测干扰前后OPNmRNA和蛋白表达水平的变化；MTT法检测MG-63细胞在OPN有无干扰时的增殖变化；通过量效曲线及时效曲线分析其生长抑制作用；平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力；通过细胞划痕实验和体外侵袭实验检测其对细胞迁徙和侵袭能力的影响。结果：RT-PCR和Western blot结果证实MG-63细胞中OPN高表达，抗OPN特异性抗体作用于MG-63细胞系结果显示，倒置显微镜观察细胞形态无明显改变；随着抗OPN特异性抗体剂量的增加和作用时间的延长，MG-63细胞中OPNmRNA和蛋白表达下调。MTT结果提示，随着抗OPN特异性抗体剂量增加和作用时间延长，MG-63细胞的增殖抑制表现出剂量依赖性和时间依赖性。平板克隆形成实验结果显示抗OPN特异性抗体组细胞克隆形成数减少；细胞划痕实验和体外侵袭实验的结果显示，其细胞迁徙能力明显减弱，侵袭能力明显下降。结论：抗OPN特异性抗体可能通过下调MG-63细胞中OPN的表达，发挥抑制骨肉瘤侵袭、转移的作用，对OPN的干扰可成为骨肉瘤转移治疗的新途径。

【关键词】 骨肉瘤；OPN；转移；抗体；化疗敏感性

 

肿瘤的转移是极其复杂的多因素、多步骤的序贯过程，Paget[16]关于肿瘤 “种子与土壤”学说认为，具有侵袭转移能力的肿瘤细胞，只有在为环境条件适宜生长的特定的器官或组织中才能生长，形成转移病灶。研究表明，OPN可以诱导恶性肿瘤细胞的迁移和浸润，参与肿瘤的侵袭、转移的全过程。针对OPN及其受体的干预，是防治肿瘤侵袭、转移的潜在靶点。

本研究利用抗OPN特异性抗体研究OPN对高侵袭转移潜能的骨肉瘤MG-63细胞系的生物学性质的影响，即细胞生长活性、克隆形成能力、迁移侵袭能力等方面，从骨肉瘤细胞体外生物学行为的变化来探讨OPN在骨肉瘤侵袭、转移过程中的作用。

1  材料与方法

1.1  细胞系与主要试剂

人骨肉瘤MG-63细胞系由中科院上海细胞生物研究所提供。抗OPN特异性抗体购自美国santa公司，碘化丙啶购自美国Sigma公司，MTT购自美国Sigma公司，临用前以PBS配制成5mg/ml浓度，过滤除菌后避光备用。二甲基亚砜(DMSO)和0.25％胰蛋白酶购自Sigma公司。RPMI-1640购自美国Gibco公司。标准胎牛血清购自天津血液病研究所。OPN和内参β-actin的一抗均购自美国santa公司。山羊抗兔二抗以及蛋白Marker购自华特生公司。

1.2  实验方法

1.2.1  细胞培养

人骨肉瘤MG-63细胞系贴壁生长在含有10％标准胎牛血清、青霉素100000U/L、链霉素100mg/L的RPMI-1640培养液中。在37℃、5％CO2及饱和湿度的恒温密闭培养箱内传代培养，0.25％胰蛋白酶消化，每2～3天消化一次，取对数生长期细胞用于实验。将抗OPN特异性抗体溶解在100％DMSO溶剂中，配成40mg/ml的浓缩液，滤器过滤除菌，－20℃备用。实验当日用完全培养基配制抗OPN特异性抗体工作液，剂量分别为0.5、1、5、10、20ug/ml。DMSO终浓度在0.4％以下，预实验证实该浓度对细胞没有影响。对照组为完全培养基。

1.2.2  倒置相差显微镜观察细胞形态

指数生长期骨肉瘤MG-63细胞系的单细胞悬液以5×105个细胞/瓶接种于25cm2培养瓶内，常规培养24h，更换含有不同浓度抗OPN特异性抗体的培养液，培养48h后，于倒置相差显微镜下观察细胞形态变化情况。

1.2.3  抗OPN特异性抗体对MG-63细胞中OPNmRNA表达的影响（RT-PCR法）

采用Primer Primer5.0进行引物设计，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。以β-actin为内参。OPN上游：5´-ATC ACC TGT GCC ATA CC- 3´；下游：5´-ACT CCT CGC TTT CCA T- 3´，扩增片断433bp。0.5、1、5、10、20ug/ml抗OPN特异性抗体作用MG-63细胞48h，以及10ug/ml 抗OPN特异性抗体作用MG-63细胞24h，48h，72h后，进行PCR反应。反应条件：30℃，10min；42℃，30min；99℃，5min；5℃，5min，反应条件94℃，2min；94℃，40sec；57℃，40sec；72℃，1min；72℃，5min。

1.2.4  抗OPN特异性抗体对MG-63细胞中OPN蛋白表达的影响（Western blot法）

0.5、1、5、10、20ug/ml抗OPN特异性抗体作用MG-63细胞48h，以及10ug/ml抗OPN特异性抗体作用MG-63细胞24h，48h，72h后，收集细胞，裂解4℃离心12000rpm，1h，考马斯亮蓝定量。加样品缓冲液煮沸5min。50ug总蛋白行12％SDS-PAGE电泳，50V恒压2h湿转蛋白至硝酸纤维素膜上，丽春红S染色检查。TTBS缓冲液洗去丽春红，含5％去脂奶粉的TTBS封闭室温1h，TTBS洗膜后，兔抗人OPN一抗封闭液4℃封闭过夜，一抗均以1:400稀释。TTBS洗2次，每次10min，再用TBS洗10min，碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗以1:2000稀释，室温1h。TTBS洗2次，每次10min，再用TBS洗10min。DAB显色，扫描仪扫描成像。

1.2.5  细胞生长抑制实验（MTT法）

收集对数生长期MG-63骨肉瘤细胞，调整细胞悬液浓度，分别接种于96孔板，每孔约100μl，含有细胞数量1×105/孔。置37℃、5%CO2培养箱培养使细胞贴壁。24小时后更换含有0.5、1、5、10、20ug/ml抗OPN特异性抗体的培养液，空白对照加入同体积的无菌PBS。每组设平行三复孔。置37℃、5%CO2培养箱培养孵育培养48小时后，倾去培养液。每孔加入180ul新鲜RPMI-1640培养液，再加入20ulMTT溶液（5ng/ml，即0.5%MTT），继续培养4小时。吸去上清，PBS轻轻洗涤，再次离心，弃上清。每孔加入180ul新鲜RPMI-1640培养液，再加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4小时。终止培养（1000rpm离心10min），吸去孔内培养液。每孔加入150ul二甲基亚砜，置室温中振荡10min，使结晶物充分溶解。然后在酶标仪上490nm波长测吸光度(OD值)，重复实验3次。另以同样试验方法检测在10ug/ml抗OPN特异性抗体作用于MG-63细胞后24、48、72小时的吸光度。利用Excel软件绘图，以细胞增殖抑制率为纵坐标，药物浓度为横坐标绘制剂量及时间效应曲线图。细胞抑制率计算公式如下：细胞抑制率率=（1－试验孔A490均值/对照孔A490均值）×100%

1.2.6  平板克隆形成实验

取对数生长期的细胞，用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，稀释后按照105个细胞/孔接种于六孔板中，10ug/ml抗OPN特异性抗体加入其中3孔，即每组3复孔，孵育48小时后，消化收集细胞，再在从中取500个细胞种于六孔板内，换新鲜培基继续培养2周，取出培养皿，弃去培养液，用1×PBS洗涤2次，3ml甲醇固定15min。弃去固定液，0.4%结晶紫染色，水洗晾干。用菌落计数法计算克隆数，求均值。形成的克隆数目除以接种细胞数，计算克隆形成率。

1.2.7细胞划痕实验

取已予10ug/ml抗OPN特异性抗体预处理细胞24小时后的MG-63细胞和对照组细胞接种于6孔培养板中（细胞数约为每孔2×104个），长至60～70%汇合，形成单细胞层。用20ul Tip头在单层细胞上划痕，造成培养细胞伤口模型，划痕后PBS冲洗2次，剩余细胞继续培养24小时，适时更换培养液。分别于0和24小时倒置显微镜下观察伤口愈合程度，即细胞迁徙能力，并拍照。

1.2.7  细胞侵袭实验

用Transwell侵袭实验检测经抗OPN特异性抗体预处理细胞24小时后骨肉瘤MG-63细胞侵袭能力的变化。以4℃的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度0.8g/L，每个Boyden小室约为100ul，分3次涂在Transwell的聚碳酸酯膜上，4℃风干。取实验组予10ug/ml抗OPN特异性抗体预处理细胞24小时后的MG-63细胞和对照组培养的MG-63细胞，调整细胞密度，按细胞数2×105 /200ul加入上室，培养基用无血清的RPMI 1640，放置于24孔侵袭培养板上。下室加入作为化学趋化物的含10%FBS的RPMI 1640培基500ul，37℃孵育24小时。然后取出培养板，弃去上室内培养基，用棉签仔细擦净膜上未侵袭的细胞以及人工基底膜胶，下室面用甲醇固定10min后，0.1%结晶紫染色，在显微镜下每张膜随机观察5个视野，并计数每个视野的细胞数。每组细胞重复3个样本，则每组迁移细胞数为15个视野的平均细胞数。

1.3  统计学处理

所有数据采用SPSS16.0统计学软件进行统计分析，以 ±s表示，进行t检验。P<0.05和P<0.01分别表示差异显著和非常显著，P>0.05无统计学意义。

2   结果

2.1  倒置相差显微镜细胞形态学观察

对照组与实验组在经48h培养后于倒置相差显微镜下观察，MG-63细胞形态无明显变化。

2.2  抗OPN特异性抗体对MG-63细胞中OPNmRNA的影响

抗OPN抗体对MG-63细胞中OPNmRNA的影响，见图2-1、2-2。0、0.5、1、5、10、20ug/ml抗OPN抗体作用MG-63细胞48h后OPNmRNA表达相对含量与对照组相比，计算相对的百分含量，见图2-3。结果显示：随着抗OPN抗体剂量增加，OPNmRNA表达逐渐减少（r＝－1，P<0.01），提示随着抗OPN抗体剂量增加，OPNmRNA表达具有剂量效应关系；10ug/ml抗OPN抗体作用MG-63细胞24h、48h、72h后OPNmRNA表达相对含量与对照组相比，计算相对的百分含量，见图2-4。结果显示：随着抗OPN抗体作用时间的延长，OPNmRNA表达明显降低，提示随着抗OPN抗体作用时间的延长，OPNmRNA表达具有时间效应关系。

  

图2-1，不同剂量及时间抗OPN抗体作用MG-63细胞OPN mRNA表达

图2-2，不同剂量及时间抗OPN抗体作用MG-63细胞β-actinmRNA表达

图2-3，抗OPN抗体对MG-63细胞中OPNmRNA的量效关系

图2-4，抗OPN抗体对MG-63细胞中OPNmRNA的时效关系

图2，抗OPN抗体对MG-63OPNmRNA表达的影响： 2-1、2-2：0、0.5、1、5、10、20ug/ml抗OPN抗体作用MG-63细胞48小时，以及抗OPN抗体10ug/ml作用MG-63细胞0、24、48、72小时后OPN及β-actinmRNA的表达；2-3、2-4：抗OPN抗体对MG-63细胞中OPNmRNA的量效关系和时效关系。

2.3  抗OPN特异性抗体对MG-63细胞中OPN蛋白的影响

抗OPN抗体对MG-63细胞中OPN蛋白的影响，见图3-1、3-2。0、0.5、1、5、10、20ug/ml抗OPN抗体作用MG-63细胞48h后OPN蛋白表达相对含量与对照组相比，计算相对的百分含量，见图3-3。结果显示：随着抗OPN抗体剂量增加，OPN蛋白表达逐渐减少（r＝－0.943，P<0.01），提示随着抗OPN抗体剂量增加， OPN蛋白表达具有剂量效应关系；10ug/ml抗OPN抗体作用MG-63细胞24h、48h、72h后OPN蛋白表达相对含量与对照组相比，计算相对的百分含量，见图3-4。结果显示：随着抗OPN抗体作用时间的延长，OPN蛋白表达明显降低，提示随着抗OPN抗体作用时间的延长， OPN蛋白表达具有时间效应关系。

图3-1，不同剂量及时间抗OPN抗体作用MG-63细胞OPN蛋白表达

图3-2，不同剂量及时间抗OPN抗体作用MG-63细胞β-actin蛋白表达

图3-3，抗OPN抗体对MG-63细胞中OPN蛋白的量效关系

图3-4，抗OPN抗体对MG-63细胞中β-actin蛋白的时效关系

图3，抗OPN抗体对MG-63OPN蛋白表达的影响：3-1、3-1：0、0.5、1、5、10、20ug/ml抗OPN抗体作用MG-63细胞48小时，以及抗OPN抗体10ug/ml作用MG-63细胞0、24、48、72小时后OPN及β-actin蛋白的表达；3-3、3-4：抗OPN抗体对MG-63细胞中OPN蛋白的量效关系和时效关系。

2.4  抗OPN特异性抗体对MG-63细胞的增殖抑制作用

2.4.1量效关系

如表2、图4所示，0.5、1、5、10、20ug/ml抗OPN特异性抗体作用MG-63细胞48h后与对照组相比抑制率为0.9％，2.2％，2.8％，10.1％，15.9％。10ug/ml以上的抗OPN特异性抗体能明显抑制MG-63细胞增殖，随着剂量增加抑制率逐渐增加（P<0.01），20ug/ml剂量组抑制率达15.9％。并且抑制作用(OD值)与抗OPN特异性抗体剂量呈高度相关性(r＝－0.97，P<0.01)，如图4所示。

表2，抗OPN特异性抗体对MG-63细胞增殖的影响（量效关系，48h）

抗OPN特异性抗体(ug/ml)

N

MTT-OD值（ ±s）

抑制率（％）

0

3

0.944±0.008

－

0.5

3

0.935±0.011

0.9

1

3

0.923±0.067

2.2

5

3

0.918±0.008

2.8

10

3

0.849±0.019*

10.1

20

3

0.794±0.013*

15.9

注：各组与对照组比较，*P<0.05。

图4，抗OPN特异性抗体对MG-63细胞增殖的影响（48h）

2.4.2时效关系

如表3所示，10ug/ml抗OPN特异性抗体作用人骨肉瘤MG-63细胞24h、48h和72h后，抑制率分别为3.8%、10.1%、13.6%。随着时间延长，抑制作用明显增强，差异有显著性（P<0.01），其作用与时间有明显相关性(r＝－0.945，P<0.01)，如图5所示。

表3，抗OPN特异性抗体对MG-63细胞增殖的影响（时效关系）

时间（h）

N

MTT-OD值

（ ±s）

抑制率（％）

0

3

0.944±0.008

－

24

3

0.908±0.031

3.8

48

3

0.847±0.007*

10.3

72

3

0.814±0.005*

13.9

注：各组与对照组比较，*P<0.05。

图5，抗OPN抗体对MG-63细胞增殖抑制作用（10ug/ml）

2.5  平板克隆形成实验

MG-63细胞在抗OPN特异性抗体作用后的平板克隆计数结果如表4。抗OPN特异性抗体作用后的MG-63细胞克隆数明显少于对照组，统计软件分析显示两组之间有明显差异，P<0.05，经抗OPN特异性抗体作用的骨肉瘤细胞MG-63集落形成率低于对照组，如图6所示。

表4，抗OPN特异性抗体作用MG-63细胞细胞平板克隆计数比较

组别

N

克隆形成率（%）

对照组

50

49.6±3.08

实验组

50

33.2±2.22

t=7.475，P=0.002

图6，抗OPN特异性抗体对MG-63细胞的克隆形成能力的影响

2.6  抗OPN特异性抗体对MG-63细胞迁移能力的影响

实验结果表明，与对照组细胞相比，抗OPN特异性抗体作用后的MG-63细胞迁移能力明显减弱，如图7所示。

图7-1、对照组（0h）

图7-2、实验组（0h）

图7-3、对照组（24h）

图7-4、实验组（24h）

图7，抗OPN特异性抗体对MG-63细胞迁移能力的影响：7-1：对照组（0h）；7-2：实验组（0h）；7-3：对照组（24h）；7-4：实验组（24h）

2.7  抗OPN特异性抗体对MG-63细胞侵袭能力的影响

体外侵袭实验结果显示，MG-63细胞培养24小时后浸润至Transwell聚碳酸醋膜下的细胞数目分别为：对照组47.6±5.5 /HP，实验组24.7±3.2/HP，明显低于对照组，见表5。经统计学分析，差异有统计学意义（p<0.01），如图9所示。

表5，抗OPN特异性抗体作用MG-63细胞细胞侵袭能力比较

t=6.247，P=0.003 

图9，抗OPN特异性抗体对MG-63细胞侵袭能力的影响

3  讨论

骨肉瘤是危害青少年身心健康的常见恶性肿瘤之一，往往在临床诊断时部分患者已经发生远处转移。因此，防治肿瘤的侵袭和转移是降低骨肉瘤患者死亡率的重要途径。本研究已证实骨肉瘤组织中OPNmRNA和蛋白的表达均与骨肉瘤远处转移相关，此结果与目前多数研究结果一致。如何从分子生物学的角度来解释这一机制，为临床提供理论基础，从而为干预这一过程的发生发展提供有效的手段，是目前研究关注的焦点之一。

研究表明，细胞外基质主要由间质胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、纤维粘连蛋白、硫肝素蛋白多糖等组成，处在不断代谢更新、降解重塑的动态平衡中，可维持肿瘤细胞生长的微环境，并可调节与其接触的肿瘤细胞的基因表达，从而影响肿瘤的代谢、生长及转移，故任何可使细胞外基质的这种动态平衡失调的物质都可能与肿瘤浸润复发等密切相关[18] [19]。OPN是一种酸性非胶原糖蛋白，既是细胞在基质中固定的“锚钉”，也是细胞在基质中游走的动力，对细胞迁移具有趋化作用[20]。

OPN是整合素和CD44家族受体的配体，通过RGD序列依赖性和非RGD序列依赖性途径与其受体有效结合而相互作用[21] [22]。OPN与受体的结合可调节粘附的细胞基质间相互作用，也可激活信号传导途径的细胞第二信使[23] [24]。肿瘤细胞分泌的OPN可作为环境因素发挥作用，形成一个细胞与基质间的互动效应，为肿瘤细胞的侵袭性生长提供生物学基础。通过活化所募集的下游信号分子，从而将胞外转导而来的信号分别传输给不同的下游信号途径，从而引起骨架重构和细胞变形[25] 。研究表明，OPN在肿瘤转移的多个环节中起关键作用，因此，靶向OPN依赖机制对多种恶性肿瘤具有潜在的干预作用。

结合目前的研究推测，骨肉瘤含有生物学特性和转移行为不完全相同的各种细胞亚群，而其中具有转移能力的细胞只占少部分，这就是肿瘤的异质性。肿瘤能否转移在很大程度上取决于具有转移潜能的细胞亚群能否转变成优势细胞，骨肉瘤MG-63细胞株是相同细胞来源的细胞株，具有非常近似的细胞生物学特性，是研究肿瘤转移适宜的配对研究材料，对于探讨骨肉瘤的转移机制、指导临床治疗具有重要的现实意义。本课题体外实验中，选择高转移性骨肉瘤细胞株MG-63作为研究对象，首先对该细胞OPNmRNA和蛋白表达水平进行验证，进一步研究抗OPN特异性抗体对骨肉瘤生物学行为的影响。

RT-PCR及Western Blot的实验结果发现，OPN在骨肉瘤MG-63细胞系中高表达，在抗OPN特异性抗体对MG-63细胞OPN的作用中，随着剂量加大、作用时间延长，OPNmRNA及蛋白的表达明显下调，表现出剂量依赖性、时间依赖性。明确证实了抗OPN特异性抗体能明显降低MG-63细胞中OPNmRNA及蛋白的表达，这可能是抗OPN特异性抗体通过抑制OPN表达以减弱骨肉瘤侵袭、转移能力的重要机制。

OPN促进细胞增殖的信号途径尚不十分清楚。它能与整合素受体avb1、avb3、avb5等[26] [27] [28]结合，其生物学功能可能是通过与整合素受体的相互作用实现的。目前认为整合素可通过活化酪氨酸激酶途径参与信号传导，在细胞粘附、铺展时，通过与支持物细胞外基质中活性部位RGD结合，使局部粘附相关激酶中酪氨酸磷酸化而活化，进而影响细胞骨架，使细胞贴壁粘附性增强，有利于细胞生存和增殖[29] [30] [31]。OPN还可以抑制NO及O2-、OH-等活性基团的产生，从而阻止炎症细胞的氧爆发，使得癌细胞在周围环境的生存率提高，促进转移细胞的生存[32]。MTT实验可检测肿瘤细胞的无限制性增生能力，抗OPN特异性抗体作用MG-63细胞实验组的生长能力较对照组明显下降，差异有统计学意义。实验结果清楚地显示了抗OPN特异性抗体可能通过对OPN的影响抑制MG-63细胞的增殖潜能。

平板克隆形成实验作为单层细胞的培养，通过观察集落的数量和大小很好的反映了细胞的恶性增殖能力，我们观察了抗OPN特异性抗体对MG-63细胞集落形成的影响，结果与上述实验有较好的符合率。克隆形成实验同时也说明细胞在没有邻近细胞共刺激的情况下，细胞生存和增殖能力降低，这也是肿瘤发生转移的一个必要因素。这些结果足以说明抗OPN特异性抗体在一定程度上确实能抑制骨肉瘤细胞MG-63细胞的增殖。

细胞迁移是正常胚胎发育、伤口愈合、炎症反应以及肿瘤细胞转移的基本过程[33]。侵袭性的肿瘤细胞通常具有较强的运动性，表现为伪足样伸展、膜流动性和向量转移等。体外实验证实肿瘤细胞的运动能力与转移倾向呈正比关系。通过细胞划痕实验观察抗OPN特异性抗体对MG-63细胞迁移能力的改变，结果表明，抗OPN特异性抗体作用于骨肉瘤MG-63细胞，导致该细胞的迁移能力明显下降。

体外侵袭实验是肿瘤体外侵袭性研究中的经典方法之一。Matrigel接近体内基底膜的成分，用此对Transwell进行包被，则只利于具备侵袭能力的细胞穿膜，而没有侵袭能力的细胞则不能穿过，目的是观察细胞通过降解细胞外基质而进行的侵袭行为。本实验结果与划痕实验相似，经抗OPN特异性抗体预处理的MG-63细胞穿过Matrigel到达下室面的数目明显减少，与对照细胞相比其侵袭能力减弱。这充分说明在体外侵袭模型中，OPN与骨肉瘤的侵袭转移密切相关，抗OPN特异性抗体对骨肉瘤细胞MG-63侵袭能力的抑制作用。

抑制OPN的表达，减弱骨肉瘤侵袭、转移的能力，是目前骨肉瘤治疗一个较有希望的研究方向，可能成为逆转肿瘤耐药，以及作为手术、化疗、放疗后的辅助治疗手段，为减少肿瘤复发和转移发挥重要作用。OPN有望成为骨肉瘤基因治疗的新靶点，为骨肉瘤的诊断治疗开启一条新途径。